動物活體成像之熒光成像的基本原理、應用領域及常見實驗技巧
熒光成像的實驗步驟
● 用熒光報告基團/熒光染料進行標記（注射入小鼠體內）。
● 小鼠經過麻醉后放入成像暗箱平臺，照明燈拍攝第一次背景。
● 照明燈自動關閉，動物成像。
常用熒光染料：DIR、DID、CY5、CY5.5
活體動物熒光成像標記的分類
熒光成像基礎
1. 熒光基團（fluorophores）
熒光基團是一類能吸收特定波長的光并發出熒光的分子或分子部分。它們是熒光染料、熒光蛋白和熒光探針等熒光物質的核心組成部分。
2. 熒光染料（fluorescent dyes）
熒光染料是一類具有熒光性質的有機化合物。熒光染料通常由以下部分組成：
熒光基團：吸收光能并發出熒光的分子部分，通常具有共軛體系。
連接基團：連接熒光基團和靶分子的分子部分。
3. 熒光配體（fluorescent ligands）
熒光配體是一類與金屬離子或其他分子特異性結合的分子，在結合后會產生熒光信號。熒光配體通常由以下幾個部分組成：
配位基團：與金屬離子或其他分子結合的官能團。
熒光基團：吸收光能并發出熒光的分子部分。
連接基團：連接配位基團和熒光基團的分子部分。
熒光成像中的挑戰和解決方案
小動物活體成像儀器在生物醫學研究中的應用日益廣泛，對熒光樣品進行成像時，有一些問題需要考慮，包括生物自發熒光、儀器性能、結果可靠性等。
1.穿透深度不足——選擇合適的熒光模塊/熒光標記
在生物組織內，光的傳播受到散射和吸收的限制，使得深層組織結構和過程的成像變得困難。妨礙了對體內病理變化的深入研究。
熒光產生包含激發和發射兩個過程，在小動物活體成像系統中具體體現為熒光光源和發射光濾光片兩個關鍵部件。
● 熒光光源
勤翔小動物活體成像系統支持LED和激光光源，覆蓋幾乎所有市面上的熒光基團。
近紅外 LED 光源能夠更深地穿透生物組織，從而提升成像深度。它的非侵入性特點減少了對樣本的影響，產生的背景干擾較少，有助于提高圖像的清晰度，提供更為準確的成像結果。
激光光源的高亮度和方向性允許光穿透更深的組織，實現深層成像，獲得小動物體內更深層的生物過程。激光可以針對特定的熒光團進行選擇性激發，從而實現特定生物過程的成像，例如上轉化成像。激光激發能夠產生高對比度圖像，非常適合于活體熒光激發。
● 發射光濾光片
發射濾光片允許熒光基團發射的特定波段的光通過。在熒光成像中用于精確選擇和增強特定波段的信號，通過適當的透過率和截止特性，可以有效提高成像質量，減少背景干擾。
● 熒光染料
染料的亮度因其各自熒光色素的不同而變化，受激發系數和熒光量子產率的雙重影響。不同染料與同一蛋白質使用時可導致背景信號的變化（Hayashi-Takanaka et al.，2014）。
FITC和DiR都是常見染料，用于標記蛋白質時，DiR的激發波長更長，能夠更深地穿透組織，成像結果更好。
2. 背景熒光過高-樣品準備和先進的算法校正
組織的自發熒光以及非特異性染料結合所產生的信號，會產生背景干擾。這些非特異信號會掩蓋實際的熒光信號，導致結果變得模糊不清，影響實驗的可靠性和準確性。
為了更好地控制背景熒光，研究人員開發了多種策略。包括選擇與自發熒光波長差異較大的熒光標記物，使用數學算法進行圖像處理等方法以減少影響。（Nicholas Billinton et al.，2001）
● 自發熒光
自發熒光來自于結構成分，從小分子到更大的結構。生物的自發熒光峰值位于500nm左右，主要由毛發、皮膚、肌肉、血紅蛋白等引起。使用近紅外光源激發小動物活體成像，可以避開這些自發熒光干擾，獲得更高的信噪比的圖像。
● 剔除毛發
未剃毛的C57BL/6小鼠皮下腫瘤的生物發光信號強度比植入到Albino B6或NMRI Nude小鼠上的相似腫瘤信號低。（Liesa-Marie Schreiber et al.，2019）
至少提前一天進行脫毛或剃毛，使用鋒利的刀片，沖洗脫毛或剃毛區域，并用無菌紗布輕輕擦拭，去除任何殘留物。
● 飼料熒光
如果需要進行消化道成像，至少提前一周使用無熒光飼料喂養動物，以避免苜蓿素的熒光干擾。（Yusuke et al., 2008）
3. 靈敏度不足——更高端的硬件
對于涉及低豐度分子或信號較弱的探針，活體成像的靈敏度常常顯得不足。這使得檢測目標分子信號變得極為困難，未能及時捕捉到關鍵的信號可能會導致研究結果的偏差。
提高成像系統靈敏度依賴于兩個關鍵組件：鏡頭和感光芯片。通過優化這兩個組件，勤翔小動物成像系統成功提升靈敏度，提供更可靠、更精確的活體成像工具。
● 鏡頭
鏡頭光圈決定透光能力，勤翔小動物活體成像系統采用f/0.8大光圈鏡頭，相比常見的f/0.95鏡頭，透光能力提升30%，成像時間更短，獲得更清晰圖像。
● 感光芯片
感光芯片的性能也影響靈敏度，其理想特性包括更大感光面積、像素尺寸、量子效率，以及更低的暗電流和背景噪聲。這些特性協同提升信噪比，實現高質量成像。
4. 數據準確性問題——專業的采集分析軟件
圖像質量和數據準確性可能受到多種因素的干擾。這些問題不僅影響了圖像的清晰度，也可能導致誤判和數據分析上的錯誤，妨礙結論的可靠性。
勤翔小動物活體成像軟件集成了強大的專用成像和分析模塊。成像模塊支持實時預覽、全自動控制，確保圖像數據的完整性和一致性。分析模塊采用先進算法，支持背景扣除、圖像增強和定量分析單位p/s/cm²/sr，進一步提高了圖像數據的準確性。軟件通過直觀的界面將這些功能集成在一起，消除人為錯誤的可能性，確保了成像結果的高度可重復性。
5. 信息單一，信號不易定位——多維成像
傳統的熒光成像技術通常只能提供單一模態的信息，缺乏多維度的綜合表征。在精確定位信號源方面的明顯不足，限制了對生物系統復雜交互作用的全面理解。
熒光成像提供了功能成像，揭示了生物過程的動態變化，例如基因表達、細胞活動和代謝。X射線成像則能提供結構信息，展示解剖結構。
結論
通過利用熒光標記和成像系統，研究人員能夠可視化和量化小動物體內特定分子、細胞和組織的分布及其動態行為。為了確保數據的高質量，本文提供了一些解決方案，以提升實驗的信噪比、分辨率和特異性。
