免疫細胞培養(yǎng)的六個基本流程：樣本制備、細胞分選、分型鑒定、擴增&培養(yǎng)、質量優(yōu)化、后續(xù)研究。今天我們繼續(xù)一起學習質量優(yōu)化的相關知識。
 

質量優(yōu)化（Quality Optimization）：針對一些不良因素，如樣本制備成單細胞懸液時產生的細胞團塊、碎片等；細胞擴增培養(yǎng)時支原體和內毒素的影響，并積極采取對應的措施。
 

1.單細胞懸液質量優(yōu)化：這部分的內容大家可以參考《單細胞懸液制備方法及質量優(yōu)化方案 》進行學習。

2.細胞培養(yǎng)質量優(yōu)化：在細胞培養(yǎng)過程，我們需要不定期進行支原體和內毒素的檢測，如果不慎“中招”，可以做到及時止損。

 

支原體 (Mycoplasma) 是介于細菌和病毒之間，沒有細胞壁的原核細胞型微生物。

 

（1）形態(tài)特征

支原體的體積很小，0.1-0.3 μm，光學顯微鏡無法觀測，也無法通過0.22μm的過濾器過濾，并且傳統(tǒng)的抗生素對支原體一般沒有效果。支原體可寄生/共生/獨立存活于培養(yǎng)基中，98%吸附于細胞膜或者細胞間隙。

 

（2）污染源

①支原體陽性細胞的交叉污染，并且由于支原體可垂直傳染，一旦細胞發(fā)生污染，下一代細胞同樣也會存在支原體的污染；

②實驗操作人員的口腔、唾液等等，實驗人員的操作習慣，如交叉使用培養(yǎng)液、防護不到位也會成為支原體的污染來源；

③培養(yǎng)條件如操作環(huán)境、培養(yǎng)用的儀器耗材清潔或滅菌不到位也都會增加支原體污染的風險。

 

（3）對細胞研究的影響

①抑制細胞生長、代謝，引起死亡：一般情況下輕度的支原體污染對于細胞的生長沒有明顯的影響，但是由于消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，所以細胞的生長會變慢，支原體也可能通過感染細胞并利用其生物合成機制，抑制關鍵代謝途徑，最終導致細胞生長受阻和死亡[1]；

②染色體畸變，破壞核酸合成，DNA片段化：支原體可能通過與細胞核酸相互作用，引發(fā)染色體結構的變異，影響DNA合成和維持染色體完整性，如支原體感染可以模擬shRNA介導的p53敲除，允許Ras轉化，從而使p53的功能失活[2]；

③改變細胞膜抗原性：支原體影響參與炎癥和細胞轉化的細胞途徑，如支原體的蛋白質與TLR相互作用或進入細胞，從而改變負責炎癥和DNA修復的幾種途徑[3]；

④改變轉染效率：支原體可能通過影響細胞內的基因轉運和表達機制，減緩或干擾DNA的轉染效率[4]；

⑤對細胞凋亡誘導劑敏感性增加：支原體可以通過某些蛋白，調節(jié)細胞凋亡途徑中的關鍵分子，增加細胞對凋亡誘導劑的敏感性，如NAE和支原體酶MGA-0676的相互作用，誘導的DF-1細胞凋亡[5]。

 

（4）支原體的預防：

支原體的污染防治也是很重要的，比如：日常1-2周進行支原體的檢測，對于新到的細胞株、凍存保種前、重要實驗開始前都應當進行支原體的檢測。10個預防支原體的tips大家可以保存學習噢（圖1）。
 

圖1 預防支原體污染的10個技巧

 

（5）支原體的檢測方法：支原體的檢測方法也非常多，小優(yōu)也給大家整理了每種方法的原理、優(yōu)缺點（表2）。

 

表2 支原體檢測方法的比較

 

（6）支原體的去除：目前最有效的支原體的清除方法是使用支原體清除劑，其他的方法比如清洗純化法（利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的）或者使用支原體特異血清也可以嘗試。

 

內毒素（endotoxin）是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，其化學本質是一種脂多糖（LPS），其單位為Eu/mg或Eu/U。一個EU相當于約0.1至0.2 ng內毒素/mL溶液。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞后才釋放出來。

（1）特征：

內毒素非常耐熱，只有在160℃，加熱2-4h，或者用強堿/強酸/強氧化劑加熱煮沸30min才能破壞其生物活性。

 

（2）污染源：

①配制各種試劑、緩沖液的水

②各種培養(yǎng)基、血清和添加劑中“混入”

③塑料器具、玻璃器具等表面

 

（3）對細胞的影響：

①細胞功能改變：內毒素可以刺激一些細胞分泌炎癥因子，導致局部炎癥反應，如低至 0.5 ng/mL 的內毒素處理6h就可以增加馬腹膜巨噬細胞中IL-6的分泌[6]；

②導致細胞亞健康： 內毒素會加速細胞衰老、凋亡，甚至死亡；

③活化細胞：在單核細胞存在的條件下，100 ng/mL內毒素可以刺激人類T細胞的增殖及其淋巴因子的產生[7]；

④降低真核細胞系的轉染效率：已純化質粒 DNA 中的內毒素可降低所有細胞系的轉染效率和活力，內毒素含量（> 10 EU/μg）會對標準細胞系中的轉染、蛋白質表達和活力產生負面影響[8]。

 

（4）內毒素的預防：

①選擇高質量/低內毒素的培養(yǎng)基、血清和試劑耗材，在免疫細胞的培養(yǎng)過程中，可以選擇免疫細胞專用的無血清培養(yǎng)基，如果選擇經典的培養(yǎng)體系，要選擇低內毒素的血清和基礎培養(yǎng)基；同時，免疫細胞培養(yǎng)的過程中添加的生長因子等也要選擇高質量低內毒素的；

②重復使用的實驗耗材可高溫高壓處理：250℃，30分鐘，或者180℃，3小時；

③細胞培養(yǎng)的水質也至關重要，賽多利斯的mini純水儀可以滿足實驗室每日15ml純水/超純水的用量，關愛每一個細胞寶寶；

④另外可以對培養(yǎng)過程中自行配置的一些緩沖液進行過濾除菌，這樣可以在加入到細胞之前消除潛在的內毒素。

 

（5）內毒素的檢測：

小優(yōu)也給大家整理了內毒素每種檢測方法的原理、優(yōu)缺點（表6）。常用的方法是鱟試劑法和重組 C因子法，由于鱟作為國家二級保護動物，目前不能再進行大規(guī)模使用。所以我們推薦大家使用重組 C因子(rFC) 法來檢測內毒素。

 

表6 內毒素的檢測方法

 

（6）內毒素的清除：

細胞培養(yǎng)中的內毒素暫時沒有方法可以有效去除，所以小優(yōu)建議大家做好預防，畢竟防大于治！

 

參考文獻：

1.Netto, Cristiane et al. [publication of the Brazilian Society for Microbiology] vol. 45,4 1513-9. 4 Mar. 2015

2.Logunov, D Y et al Oncogene vol. 27,33 (2008): 4521-31.

3.Benedetti, Francesca et al. “Mycoplasmas-Host Interaction: Mechanisms of Inflammation and Association with Cellular Transformation.” Microorganisms vol. 8,9 1351. 4 Sep. 2020

4.Yin, Zi-Fei et al. “Mycoplasma contamination-mediated attenuation of plasmid DNA transfection efficiency is augmented via L-arginine deprivation in HEK-293 cells.” Journal of Zhejiang University. Science. B vol. 20,12 (2019): 1021-1026

5.Li, Peng et al. “Mechanism of Apoptosis Induction by Mycoplasmal Nuclease MGA-0676 in Chicken Embryo Fibroblasts.” Frontiers in cellular and infection microbiology vol. 8 105. 4 Apr. 2018

6.Morris,D.D., Crowe, N., Moore, J.N.and Moldawer, L.L. Endotoxin-Induced Production ofInterleukin 6 by Equine Peritoneal Macrophages In Vitro. Am. J. Vet. Res.53:1298-1301 (1992

7.Mattern, T.,Thanhauser, A., Reiling, N.,Toellner, K., Duchrow, M., Kusumoto, S.,Rietschel,E.T., Ernst, M., Brade, H.,Flad, H.D. and Ulmer, A.J. Endotoxin and Lipid A StimulateProliferation of Human T Cells In the Presence of Autologous Monocytes. J.Immunol. 153:2996-3004(1994)

8.Butash, KA et al.(2000) Reexamination of the Effect of Endotoxin on Cell Proliferation and Transfection Efficiency.Biotechniques 29(3): 610-614, 616, 618-619