THP-1/STING點突變細胞系在揭示STING的自我抑制和激活機制中的應用
雙鏈DNA（dsDNA）作為病原體入侵和細胞受損的信號，可激活機體的固有免疫反應。細胞內dsDNA的主要傳感器之一是環狀GMP-AMP合酶（cGAS），它以ATP和GTP為底物合成cGAMP。cGAMP作為第二信使，激活干擾素基因刺激因子（STING）。活化的STING從內質網向高爾基體轉運，并激活TANK結合激酶1（TBK1）和干擾素調節因子3（IRF3），從而促進干擾素刺激基因的轉錄，最終形成抗感染的免疫應答。STING的異常激活與自身免疫性疾病和炎癥性疾病有關。因此，揭開STING的作用機制對于開發抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病的療法至關重要。之前的多項研究揭開了STING的激活機制，但對STING的自我抑制機制仍知之甚少。
近日，山西高等創新研究院尚桂軍團隊、盧德芬團隊與中科院微生物所高福團隊、南方科技大學王培毅團隊合作，深入分析了STING的自我抑制和內質網滯留機制。這篇發表在《Molecular Cell》上的論文描繪了一幅STING自我抑制和激活的全景圖，大大加深了對cGAS-STING信號通路的了解。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員表達了多個物種（包括人類、小鼠、豬和雞）的STING蛋白質，并通過冷凍電鏡（Cryo-EM）分析了全長STING聚合物的結構。在分析某個氨基酸的改變對STING蛋白結構穩定性時，作者使用了多株基于CRISPR-Cas9技術構建的THP-1/STING點突變細胞系，來模擬STING內源性突變對STING蛋白結構影響，THP-1/STING點突變細胞系由賽業生物提供。
技術路線
01 通過冷凍電鏡等技術對apo-STING寡聚體的結構進行表征
02 通過共聚焦顯微鏡和突變分析來確定apo-STING中的關鍵結構
03 通過晶體堆積和冷凍電鏡分析來確定STING-cGAMP的結構
04 比較STING在靜息和活化狀態下的結構
研究結果
1.apo-STING在LBD介導下形成雙層結構
STING由N端的跨膜結構域（TMD）和C端的胞質配體結合結構域（LBD）組成。以往的研究發現，STING定位在內質網上，以同源二聚體的形式存在，而LBD處于開放狀態。與cGAMP結合后，STING的LBD相對于TMD順時針旋轉180°，并形成一個蓋子結構，將配體包在其中。分析還發現活化的STING形成更高階的寡聚體，但STING-cGAMP復合物組裝的細節仍不清楚。
內質網滯留對維持STING的非活性狀態至關重要，而STING的異常轉運會導致其以不依賴配體的方式激活。由于STING沒有明顯的內質網滯留信號，STIM1蛋白被認為是STING的結合伙伴，使其滯留在內質網上。近年來報道了幾例嬰兒STING相關血管病變（SAVI）患者，他們的STING被組成型激活。于是，研究人員想了解STING如何被抑制以及如何滯留在內質網上。
研究人員首先通過非變性凝膠電泳（native PAGE）實驗，發現多個物種的STING在靜息狀態下以寡聚體形式存在。apo-STING（未結合配體的）寡聚體在非變性膠中不穩定，而cGAMP刺激能夠提高STING寡聚體的穩定性。通過冷凍電鏡分析，他們發現apo-STING表現出一種頭對頭和肩并肩的雙層結構，像拉鏈一樣將內質網兩層膜連在一起（圖1）。此外，這種類型的STING組裝也出現在雞、牛和豬等其他物種中，表明這種組裝方式在進化上是保守的。
apo-STING寡聚體的結構[1]
通過對寡聚體結構的進一步分析，研究人員發現只有每個STING二聚體的LBD介導了相互作用，而TMD沒有參與，彼此之間的距離約為15A°。LBD α2螺旋與α3螺旋之間的環（LBDα2-α3 loop）介導了apo-STING寡聚體的肩并肩組裝。有研究表明位于STING二聚體的突變會以推動LBD的旋轉，從而導致STING的異常激活，而引入外源點突變的STING很難解釋這種現象，為了更好的確認這些位點突變的影響，作者委托賽業生物進行THP-1/STING點突變細胞株的構建，模擬STING內源突變是否導致會以不依賴cGAMP的方式激活STING。
將Q273殘基突變為E273殘基后，研究人員發現STING通路的基礎磷酸化水平要高得多，且IFN-β活性升高，即使沒有cGAMP的刺激，STING foci的形成也會增加。當S275突變為N275時，蛋白變體在沒有cGAMP的情況下變得高度激活，表明這一替換極大破壞了STING自我抑制構象的穩定性。這些結果顯示，LBDα2-α3 loop在維持STING的自我抑制方面起著重要作用。
在頭對頭的STING相互作用中，由殘基L230和P231組成的疏水性LP motif發揮了關鍵作用。令人驚訝的是，他們發現非活性狀態的STING采用了一種封閉構象，帶有一個蓋子，與以往的開放構象形成了鮮明的對比。其中，一個單體內的LP motif由于翻轉90°導致蓋子區域內經典LBDβ2-β3 loop中的返回鏈與非經典LBDβ2-β3 loop中的起始鏈之間形成平行β折疊片層結構，而不同于結合cGAMP后的反平行β折疊片層結構（圖2）。這種由LP motif和LBD的疏水裂隙介導的頭對頭相互作用將STING的兩層粘在一起。
apo-STING雙層的頭對頭相互作用[1]
2.STING-cGAMP復合物的結構
此外，通過晶體堆積分析和冷凍電鏡研究，研究人員發現STING-cGAMP復合物通過肩并肩堆積形成了多聚結構（圖3）。高分辨率的電鏡圖像顯示，STING-cGAMP復合物的整體結構從側面看呈彎曲狀。其他多個物種的STING-cGAMP復合物結構也類似，表明這種構象在進化上是保守的。相鄰的STING二聚體之間的相互作用不僅發生在LBD上，也存在于TMD之間。
STING-cGAMP復合物的整體結構[1]
3.STING非活化和活化狀態的結構比較
根據前面的分析，STING在靜息和活化狀態下都能形成寡聚體，明顯的區別在于，自我抑制的STING形成了雙層絲狀結構，而活化的STING則形成彎曲的單層絲狀結構。STING的靜息狀態是由LBD通過順式和反式的頭對頭和肩并肩堆積來維持的，而STING的活化狀態則僅通過順式LBD和TMD的相互作用來穩定。盡管STING的兩種狀態都采用封閉構象，但這兩個蓋子的構象是不同的（圖2）。
在比較兩種狀態下的結構后，研究人員認為彎曲的STING寡聚體可以使內質網膜變形，并推動STING向前運輸。相比之下，在靜息狀態下，STING的雙層結構讓兩層平行的內質網膜緊密接觸，使得STING滯留在內質網中。這些結果表明，apo-STING寡聚體結構代表了STING的自我抑制狀態，而LBD在維持其自我抑制方面起了重要作用。
研究結論
綜上所述，研究人員發現apo-STING在靜息狀態下形成雙層結構的寡聚體，將內質網的兩層膜連在一起，STING據此完成了內質網滯留和自我抑制。活化的STING則采用彎曲的構象，使內質網膜變形，便于其前向運輸。這種自我抑制和活化的結構為人們了解STING的生理和病理作用提供了大量信息，并為合理設計藥物以控制STING活性提供了可能。
原文檢索：
[1]Liu S, Yang B, Hou Y, Cui K, Yang X, Li X, Chen L, Liu S, Zhang Z, Jia Y, Xie Y, Xue Y, Li X, Yan B, Wu C, Deng W, Qi J, Lu D, Gao GF, Wang P, Shang G. The mechanism of STING autoinhibition and activation. Mol Cell. 2023 May 4;83(9):1502-1518.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2023.03.029.
