防范轉(zhuǎn)基因花粉擴撒：花粉自清除CRISPR/Cas系統(tǒng)(PSEC)的開發(fā)
近年來隨著基因編輯技術的發(fā)展及在農(nóng)作物育種領域的應用，相對于傳統(tǒng)育種周期的8-10年，基因編輯育種可將育種周期縮短至3年左右，并可快速精準創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，有效提高作物產(chǎn)量、抗病蟲害特性及品質(zhì)性狀等。比如基因編輯的水稻品種畝產(chǎn)提高15%以上、油酸含量達到80%以上的基因編輯大豆、產(chǎn)量提高10%以上的基因編輯玉米、抗除草劑小麥、強化甜度的草莓、強化風味的蔬菜等。全球范圍內(nèi)，基因編輯已經(jīng)在水稻、玉米、大豆、小麥和番茄等農(nóng)作物以及豬、牛、羊等農(nóng)業(yè)動物中廣泛應用，糯玉米、高油酸大豆、抗褐變馬鈴薯、高GABA番茄、抵抗褐變的蘑菇等基因編輯產(chǎn)品陸續(xù)在美國、日本等國家上市推廣。
CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)具有靶向精準、操作簡便、突變類型豐富、應用范圍廣、效率高等突出優(yōu)勢，已成為農(nóng)作物遺傳改良的主要技術工具。當前，通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas是植物基因編輯的主要途徑。然而，有性繁殖植物中，轉(zhuǎn)基因元件可通過植物的花粉向自然與農(nóng)業(yè)環(huán)境中擴散傳播。玉米是典型的異交授粉植物，一個單株可產(chǎn)生200萬至500萬粒花粉，可能帶來非預期的生物安全管理風險。前人已報道了一種“自殺式”轉(zhuǎn)基因策略，可以產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因的基因編輯植物以解決轉(zhuǎn)基因擴散問題，對無性繁殖植物因無減數(shù)分裂重組以去除轉(zhuǎn)基因成分，該方法也是理想的生物安全管理解決方案。然而，有多個基因編輯生物育種技術場景仍需活體中保持CRISPR/Cas存在，持續(xù)發(fā)生基因編輯靶向突變活性。因此，研發(fā)一種既沒有花粉擴散轉(zhuǎn)基因風險，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術，尤為必要。此外，玉米是世界上主要的糧食作物，緊湊矮桿等耐密株型遺傳改良是當代玉米遺傳與育種主要方向，降低株高具有抗倒、增密增產(chǎn)等農(nóng)學意義。以某個特定的品種為“底盤”，創(chuàng)制系列降低株高同型衍生品種，對擴大該品種適應生態(tài)區(qū)域與生產(chǎn)應用推廣，具有重要價值。
近日，中國農(nóng)業(yè)科學院作科所及西北農(nóng)林科技大學的聯(lián)合研究團隊在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究論文，介紹了研究團隊開發(fā)了一種花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多個生長調(diào)節(jié)因子-GRF，通過引入花粉特異表達的能量耗竭元件，成功實現(xiàn)了含有PSEC元件的單倍體花粉不育，導致玉米植株世代穩(wěn)定維持PSEC元件半合子雜合體，PSEC僅能通過雌性配子體向下一代遺傳。同時，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因編輯活性，基于同一個材料創(chuàng)制出系列株高版本的同型衍生品系。
為了開發(fā)程序化的PSEC系統(tǒng)，研究團隊在CRISPR/Cas9載體T-DNA中引入了一個雄性配子體失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，該基因由一個花粉特異性啟動子驅(qū)動（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（圖1A）。含有PSEC轉(zhuǎn)基因的花粉是不能存活的，但PSEC轉(zhuǎn)基因可以通過雌配子體遺傳給下一代（圖1B）。與受體材料雜交時，PSEC的Cas編輯活性被保留下來，并能產(chǎn)生新的等位基因靶向突變（圖1C）。同時，研究團隊設計了PSEC來靶向編碼三種生長調(diào)節(jié)因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并獲得了單一或多個突變體（圖1A）。
研究團隊利用PSEC針對玉米自交系ZC01的未成熟胚胎進行農(nóng)桿菌介導的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，結(jié)果分離出25個獨立的T0轉(zhuǎn)化體。在對目標突變進行初步評估后，研究團隊選擇了5個轉(zhuǎn)化體，通過數(shù)字液滴PCR來表征其PSEC拷貝數(shù)（圖1D）。株系3-1和24-1攜帶一個PSEC轉(zhuǎn)基因拷貝（圖1D），入選特征分析的對象。株系3-1像野生型一樣生長和開花，有正常的雄蕊和花藥。經(jīng)過KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊顏色淺，近一半的3-1單株花粉粒缺乏紫色的染色（圖1E）。這些觀察結(jié)果與研究團隊以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方檢驗所示（χ2 < χ20.05,1；圖1F），符合PSEC單拷貝的預期分離率。為了確認PSEC的存在與否，研究團隊仔細地在體視顯微鏡下從株系3-1中采集了大約100個染色的花粉和100個未染色的花粉，并進行基因組DNA提取和Cas9 PCR擴增，三次重復。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC轉(zhuǎn)基因（圖1G）。
研究團隊對株系3-1、3-4和3-7的自交后代進行基因型鑒定，通過Sanger測序確定目標突變，鑒定到Cas9陰性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的純合單、雙、三突變組合。這套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突變體可同時用于基因功能研究和育種（圖1H），所有突變體都比WT短（圖1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三個突變體可能不會產(chǎn)生基因剔除（KO），而可能產(chǎn)生弱等位基因。研究團隊進一步對上述確認的KO突變的后代進行基因型鑒定和特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其保留的PSEC的高突變活性。
為了研究PSEC轉(zhuǎn)基因如何傳播和遺傳，研究團隊用PSEC轉(zhuǎn)基因T1作為花粉供體或受體與三個玉米自交系JD96M、D96F和B73雜交（圖1I）。當使用株系3-2、3-3、3-6作為花粉供體時，通過PCR對JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6雜交產(chǎn)生的272、357和272個F1種子進行Cas9的基因型鑒定。結(jié)果顯示，沒有一個種子攜帶Cas9基因，表明PSEC不能通過3-2、3-3和3-6花粉傳播和遺傳。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73雜交產(chǎn)生的所有F1種子中約有一半檢測到PSEC。這些數(shù)據(jù)與PSEC只能通過雌配子體傳播和遺傳的預期相一致。
為了測試可遺傳的PSEC轉(zhuǎn)基因是否表現(xiàn)出有效的靶向突變活性，研究團隊用株系3-1作為雌性親本，對上述每個雜交的40個F1種子進行基因型鑒定。在所有F1種子中，17.5-95%單株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每個靶點上都有所需的純合/雙等位突變（圖1I）。這些數(shù)據(jù)表明，所需的突變可以通過以PSEC為母本的雜交有效產(chǎn)生。
總之，研究團隊開發(fā)了一種既沒有花粉擴散轉(zhuǎn)基因風險，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術的基因編輯技術，該技術適用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技術；研究團隊同時還創(chuàng)制了靶向ZmGRF獲得特定品種系列矮桿同型衍生品種技術，為矮桿育種提供了新的技術策略和解決方案，具有種業(yè)應用潛力與價值。
北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術與表型服務中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務平臺。中心建立了基因克隆和載體平臺、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺、表型鑒定分析平臺、數(shù)據(jù)分析和利用平臺等現(xiàn)代化生物技術和信息支持平臺，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務平臺。
基因編輯服務+靶向測序服務方案
為了縮短您的育種進程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術與表型服務中心將為您提供水稻基因編輯服務。本方案利用基因編輯酶系統(tǒng)編輯供試材料的目的基因，在不改變其他基因的情況下迅速獲取一批目的基因缺失型突變體。解決傳統(tǒng)雜交選育中存在的周期長，基因連鎖等難題。
技術路線：
靶向測序服務
靶向測序技術主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術（GenoBaits）兩種。可完成單樣品50-5000和3000-40000標記的基因型分析，并達到可設計區(qū)域覆蓋度高于95%，擴增子均一性高于90%的捕獲效率。
應用領域：
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CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)具有靶向精準、操作簡便、突變類型豐富、應用范圍廣、效率高等突出優(yōu)勢，已成為農(nóng)作物遺傳改良的主要技術工具。當前，通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas是植物基因編輯的主要途徑。然而，有性繁殖植物中，轉(zhuǎn)基因元件可通過植物的花粉向自然與農(nóng)業(yè)環(huán)境中擴散傳播。玉米是典型的異交授粉植物，一個單株可產(chǎn)生200萬至500萬粒花粉，可能帶來非預期的生物安全管理風險。前人已報道了一種“自殺式”轉(zhuǎn)基因策略，可以產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因的基因編輯植物以解決轉(zhuǎn)基因擴散問題，對無性繁殖植物因無減數(shù)分裂重組以去除轉(zhuǎn)基因成分，該方法也是理想的生物安全管理解決方案。然而，有多個基因編輯生物育種技術場景仍需活體中保持CRISPR/Cas存在，持續(xù)發(fā)生基因編輯靶向突變活性。因此，研發(fā)一種既沒有花粉擴散轉(zhuǎn)基因風險，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術，尤為必要。此外，玉米是世界上主要的糧食作物，緊湊矮桿等耐密株型遺傳改良是當代玉米遺傳與育種主要方向，降低株高具有抗倒、增密增產(chǎn)等農(nóng)學意義。以某個特定的品種為“底盤”，創(chuàng)制系列降低株高同型衍生品種，對擴大該品種適應生態(tài)區(qū)域與生產(chǎn)應用推廣，具有重要價值。
近日，中國農(nóng)業(yè)科學院作科所及西北農(nóng)林科技大學的聯(lián)合研究團隊在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究論文，介紹了研究團隊開發(fā)了一種花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多個生長調(diào)節(jié)因子-GRF，通過引入花粉特異表達的能量耗竭元件，成功實現(xiàn)了含有PSEC元件的單倍體花粉不育，導致玉米植株世代穩(wěn)定維持PSEC元件半合子雜合體，PSEC僅能通過雌性配子體向下一代遺傳。同時，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因編輯活性，基于同一個材料創(chuàng)制出系列株高版本的同型衍生品系。
為了開發(fā)程序化的PSEC系統(tǒng)，研究團隊在CRISPR/Cas9載體T-DNA中引入了一個雄性配子體失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，該基因由一個花粉特異性啟動子驅(qū)動（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（圖1A）。含有PSEC轉(zhuǎn)基因的花粉是不能存活的，但PSEC轉(zhuǎn)基因可以通過雌配子體遺傳給下一代（圖1B）。與受體材料雜交時，PSEC的Cas編輯活性被保留下來，并能產(chǎn)生新的等位基因靶向突變（圖1C）。同時，研究團隊設計了PSEC來靶向編碼三種生長調(diào)節(jié)因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并獲得了單一或多個突變體（圖1A）。
圖1花粉自清除CRISPR/Cas9（PSEC）消除含有轉(zhuǎn)基因的花粉并保留目標突變
研究團隊利用PSEC針對玉米自交系ZC01的未成熟胚胎進行農(nóng)桿菌介導的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，結(jié)果分離出25個獨立的T0轉(zhuǎn)化體。在對目標突變進行初步評估后，研究團隊選擇了5個轉(zhuǎn)化體，通過數(shù)字液滴PCR來表征其PSEC拷貝數(shù)（圖1D）。株系3-1和24-1攜帶一個PSEC轉(zhuǎn)基因拷貝（圖1D），入選特征分析的對象。株系3-1像野生型一樣生長和開花，有正常的雄蕊和花藥。經(jīng)過KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊顏色淺，近一半的3-1單株花粉粒缺乏紫色的染色（圖1E）。這些觀察結(jié)果與研究團隊以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方檢驗所示（χ2 < χ20.05,1；圖1F），符合PSEC單拷貝的預期分離率。為了確認PSEC的存在與否，研究團隊仔細地在體視顯微鏡下從株系3-1中采集了大約100個染色的花粉和100個未染色的花粉，并進行基因組DNA提取和Cas9 PCR擴增，三次重復。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC轉(zhuǎn)基因（圖1G）。
研究團隊對株系3-1、3-4和3-7的自交后代進行基因型鑒定，通過Sanger測序確定目標突變，鑒定到Cas9陰性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的純合單、雙、三突變組合。這套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突變體可同時用于基因功能研究和育種（圖1H），所有突變體都比WT短（圖1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三個突變體可能不會產(chǎn)生基因剔除（KO），而可能產(chǎn)生弱等位基因。研究團隊進一步對上述確認的KO突變的后代進行基因型鑒定和特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其保留的PSEC的高突變活性。
為了研究PSEC轉(zhuǎn)基因如何傳播和遺傳，研究團隊用PSEC轉(zhuǎn)基因T1作為花粉供體或受體與三個玉米自交系JD96M、D96F和B73雜交（圖1I）。當使用株系3-2、3-3、3-6作為花粉供體時，通過PCR對JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6雜交產(chǎn)生的272、357和272個F1種子進行Cas9的基因型鑒定。結(jié)果顯示，沒有一個種子攜帶Cas9基因，表明PSEC不能通過3-2、3-3和3-6花粉傳播和遺傳。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73雜交產(chǎn)生的所有F1種子中約有一半檢測到PSEC。這些數(shù)據(jù)與PSEC只能通過雌配子體傳播和遺傳的預期相一致。
為了測試可遺傳的PSEC轉(zhuǎn)基因是否表現(xiàn)出有效的靶向突變活性，研究團隊用株系3-1作為雌性親本，對上述每個雜交的40個F1種子進行基因型鑒定。在所有F1種子中，17.5-95%單株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每個靶點上都有所需的純合/雙等位突變（圖1I）。這些數(shù)據(jù)表明，所需的突變可以通過以PSEC為母本的雜交有效產(chǎn)生。
總之，研究團隊開發(fā)了一種既沒有花粉擴散轉(zhuǎn)基因風險，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術的基因編輯技術，該技術適用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技術；研究團隊同時還創(chuàng)制了靶向ZmGRF獲得特定品種系列矮桿同型衍生品種技術，為矮桿育種提供了新的技術策略和解決方案，具有種業(yè)應用潛力與價值。
—— 參考文獻 ——
Wang, H., Qi, X., Zhu, J., et al. Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize[J]. Plant Communications, 2023, 100637.
基因編輯服務+靶向測序服務方案
為了縮短您的育種進程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術與表型服務中心將為您提供水稻基因編輯服務。本方案利用基因編輯酶系統(tǒng)編輯供試材料的目的基因，在不改變其他基因的情況下迅速獲取一批目的基因缺失型突變體。解決傳統(tǒng)雜交選育中存在的周期長，基因連鎖等難題。
技術路線：
靶向測序服務
靶向測序技術主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術（GenoBaits）兩種。可完成單樣品50-5000和3000-40000標記的基因型分析，并達到可設計區(qū)域覆蓋度高于95%，擴增子均一性高于90%的捕獲效率。
GenoPlex基于多重PCR的靶向基因捕獲技術方案
GenoBaits基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術方案
應用領域：
| 種質(zhì)資源分析 | 分子標記輔助選擇 |
| 分子標記輔助回交改良 | 全基因組選擇 |
| 全基因組關聯(lián)分析 | 遺傳圖譜構(gòu)建 |
| QTL定位 |
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