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組蛋白及其翻譯后修飾在調控基因表達和其他染色質模板化過程中起著重要作用。組蛋白H3賴氨酸4三甲基化（H3K4me3）和組蛋白H3K27me3分別在小鼠植入前胚胎的基因激活和基因抑制中發揮重要作用。H3K4me3和H3K27me3組成的染色質區域稱為二價結構域，在小鼠胚胎干細胞（mESC）中普遍存在。由二價結構域標記的基因通常處于蓄勢狀態，可迅速激活以響應發育線索。多梳抑制復合體2（polycomb repressive complex 2，PRC2）介導染色質H3K27me3（包括二價結構域）；而H3K4me3對于阻止這些基因DNA甲基化至關重要。那么二價結構域是如何建立和調控的呢？
 
2023年05月27日，復旦大學生物醫學研究院/上海市醫學表觀遺傳學重點實驗室沈宏杰/徐文綺和牛津大學yang shi教授合作以“METTL14 regulates chromatin bivalent domains in mouse embryonic stem cells”為題在《cell reports》期刊發表研究論文，該研究以小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cell，mESC)為研究對象，通過染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）、RNA-seq等研究揭示了METTL14在調控二價結構域和基因表達中的作用。
 

標題：METTL14 regulates chromatin bivalent domains in mouse embryonic stem cells（METTL14調控小鼠胚胎干細胞中的染色質二價結構域）
時間：2023-05-27
期刊：cell reports
影響因子：IF 9.995
技術平臺：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
 
摘要：
METTL14（methyltransferase-like 14）是一種RNA結合蛋白，可與METTL3結合以介導N6-甲基腺苷（m6A）甲基化。最近的研究表明了METTL3在小鼠胚胎干細胞（mESC）異染色質中的作用，但METTL14在小鼠胚胎干細胞異染色質中的分子功能尚不清楚。本研究分析了METTL14特異性地結合和調控以H3K27me3 H3K4me3為標記的二價結構域。研究結果表明，METTL14基因敲除導致H3K27me3水平降低，以及H3K4me3水平升高導致轉錄增加。METTL14對二價結構域的調控與METTL3或m6A修飾無關。METTL14通過與H3K27甲基轉移酶多梳抑制復合體2（PRC2）和H3K4去甲基化酶KDM5B互作并可能將其招募到染色質，從而增強H3K27me3并減少H3K4me3。本研究揭示了METTL14在維持mESC中二價結構域完整性中的作用，且與METTL3無關，從而表明哺乳動物中二價結構域的調控機制。
 

研究圖形摘要

 
研究要點：

• METTL14主要在小鼠胚胎干細胞的二價結構域中富集
• METTL14缺失導致二價結構域中的H3K27me3減少和H3K4me3增加
• METTL14調控二價結構域，與METTL3或m6A修飾無關
• METTL14可能招募H3K27me3甲基轉移酶PRC2和H3K4me3去甲基化酶KDM5B

1. ChIP-seq揭示METTL14主要與二價結構域結合

圖1：METTL14與二價結構域結合

（A）親本細胞系和METTL14-KO細胞系中METTL14 peaks（n=3179）的METTL14水平分布熱圖。
（B） METTL14和METTL3 peaks之間重疊的Venn圖。p=1.24e−175，Fisher精確檢驗。
（C） METTL14 peaks與不同組蛋白修飾peaks重疊率條形圖（Jaccard統計）。
（D） UCSC基因組瀏覽器快照顯示METTL14和組蛋白修飾在代表性二價結構域的結合模式。
（E） METTL14 peaks和二價結構域之間的重疊Venn圖。p=0，Fisher精確檢驗。
（F） METTL14靶基因和二價基因之間的重疊Venn圖。p=0，Fisher精確檢驗。
*熱圖根據（A）中親本細胞中METTL14水平的降序排列。H3K4me3和H3K27me3 ChIP-seq兩個重復。
 
（2）METTL14 缺失導致二價結構域的H3K27me3降低和H3K4me3水平升高

圖2：METTL14調控二價結構域的組蛋白修飾

（A-B）親本細胞系和Mettl14-KO細胞系中二價結構域（n=4863）處H3K27me3（A）和H3K4me3（B）的平均富集聚合圖。
（C） UCSC基因組瀏覽器快照顯示親本細胞系和Mettl14-KO細胞系中代表性二價結構域上組蛋白修飾的結合模式。
（D）親本細胞系中二價結構域（n=4863）的METTL14水平熱圖。
（E-F）H3K27me3（E）和H3K4me3（F）在二價結構域（n=4863）的ChIP-seq倍數變化（log2（Mettl14 KO/親本））熱圖。
（G） METTL14在二價結構域的水平（log2（density））箱形圖，根據METTL14結合水平分布從高到低分為四組（1、2、3和4組分別n=1216、1216、1216和1215個peaks）。∗∗p＜0.0001（從左到右的精確p值：0、0和0），雙側配對t檢驗。
（H-I）H3K27me3（H）和H3K4me3（I）在四組二價結構域上的ChIP-seq倍數變化箱形圖（log2（Mettl14 KO/親本）），如（G）所示p＜0.01，****p＜0.0001（H從左到右的精確p值：2.34e-06、2.12e-09和8.60e-03；I從左到右的精確p值：3.45e-30、1.52e-16和1.19e-07），雙側t檢驗。

（3）METTL14缺失導致二價基因轉錄增加

圖3：METTL14調控二價基因的轉錄

（A） 親本細胞系和METTL14-KO細胞系中METTL14結合二價基因（n=1840），METTL14未結合二價基因（n=2044）和其他METTL14結合基因（n=641）的RNA-seq基因表達箱形圖（log2（RPKM））p<0.0001（從左到右的精確p值：8.08-10、3.35e-01和5.09e-01），雙側t檢驗。
（B） 與圖2G中的四組二價結構域相關的二價基因RNA-seq基因表達倍數變化箱形圖（log2（Mettl14-KO/親本））（1、2、3和4組分別n=1087、1035、973和789個基因）。**p<0.01，****p<0.0001（從左到右的精確p值：2.19e–14、5.14e–03和3.25e–01），雙側t檢驗。
（C）  qRT-PCR分析親本細胞系和Mettl14-KO細胞系中二價基因（Foxa2、Irx3、Hoxd11）的相對表達水平。顯示了三個生物學重復的平均值±SDp<0.05，**p<0.01（從左到右的精確p值：3.69e–02、2.50e–03、9.81e–03和9.70e–01），雙側t檢驗。
（D–F） UCSC基因組瀏覽器快照顯示了親本細胞系和Mettl14-KO細胞系中二價基因（Foxa2、Irx3、Hoxd11）的轉錄水平。
 
（4）METTL14調控二價結構域，與METTL3無關

圖4：METTL14調控二價結構域與m6A無關

（A-B） 親本細胞系、Mettl14-KO細胞系和含有METTL14-WT、METTL14-R298A或METTL14-D312A的挽救細胞系的二價結構域（n=4863）中的H3K27me3（A）和H3K4me3（B）的水平分布。
（C-D） H3K27me3（C）和H3K4me3（D）在二價結構域中第1組和第4組上的水平分布（log2（density）），如圖2G所示，在親本細胞系、Mettl14-KO細胞系和含有METTL14-WT、METTL14-R298A或METTL14-D312A的挽救細胞系中p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001（C從左到右的精確p值：1.38e–80、5.18e–52、1.14e–56、3.78e–58、1.08e–44、1.22e–01、6.66e–01和1.68e–05；D從左到右的精確p值：1.67e–78、2.75e–64、4.01e–44、3.61e–61、1.04e–06、1.92e–04、1.28e E–02和8.82e–10），雙側t檢驗。
 
（5）METTL14與H3K4me3甲基轉移酶復合體PRC2和H3K4me3去甲基化酶KDM5A和KDM5B互作

圖5：二價結構域中的PRC2和KDM5A/5B定位與METTL14相關

（A） METTL14和PRC2復合體（EZH2、EED、SUZ12）的相互免疫沉淀Western blot實驗。
（B） METTL14和KDM5A/KDM5B相互免疫沉淀Western blot實驗。
（C） METTL14和PRC2復合體（EZH2、EED、SUZ12）的體外下拉Western blot實驗。
（D） METTL14和KDM5A（左）以及KDM5B（右）的體外下拉Western blot實驗。
（E）  METTL14和EZH2以及EED和SUZ12之間的重疊Venn圖（從左到右的精確p值：0、0和0）。Fisher精確檢驗。
（F） UCSC基因組瀏覽器快照顯示親本細胞系中METTL14、EZH2、EED和SUZ12在二價結構域的水平分布。
（G-H）METTL14與KDM5A（G）和KDM5B（H）之間的重疊Venn圖（G的精確p值：8.07e–41；H的精確p值：0），Fisher精確檢驗。
（I–J）親本細胞系中KDM5A（I）和KDM5B（J）在二價結構域（n=4863）中的水平分布熱圖。
 
（6）METTL14與PRC2和KDM5B共定位，是PRC2在二價結構域結合所必需的

圖6：在二價結構域中，METTL14調控PRC2

（A–C）  親本細胞系和Mettl14-KO細胞系中二價結構域（n=4863）中的EZH2（A）、EED（B）和SUZ12（C）水平分布熱圖。
（D–F）  EZH2（D）、EED（E）和SUZ12（F）在四組二價結構域上的ChIP-seq倍數變化箱形圖（log2（Mettl14 KO/親本）），如圖2G所示p＜0.05，****p＜0.0001（D從左到右的精確p值：1.71e–02、3.50e–13、5.34e–08；E從左到右的精確p值：3.74e–07、3.04e–27和1.80e–12；F從左到右的精確p值：7.19e–145、1.79e–71和6.19e–06），雙側t檢驗。
（G）   METTL14調控PRC2和KDM5B在二價結構域的定位示意圖模型。METTL14缺失導致H3K27me3降低和H3K4me3增加以及隨后METTL14結合二價基因的激活。

參考文獻：
Mu M, Li X, Dong L, Wang J, Cai Q, Hu Y, Wang D, Zhao P, Zhang L, Zhang D, Cheng S, Tan L, Wu F, Shi YG, Xu W, Shi Y, Shen H. METTL14 regulates chromatin bivalent domains in mouse embryonic stem cells. Cell Rep. 2023 Jun 13;42(6):112650.