一、細(xì)胞簡介：

　　細(xì)胞名稱：TC-1小鼠肺上皮細(xì)胞

　　平臺編號:zl-056881

　　二．細(xì)胞的培養(yǎng)

　　1）準(zhǔn)備1640培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

　　2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

　　3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

　　三、細(xì)胞處理：

　　1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

　　將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

　　2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

　　對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

　　1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

　　2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

　　3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

　　四、應(yīng)用

　　用于熊果酸誘導(dǎo)TC-1癌細(xì)胞自噬性死亡中線粒體相關(guān)機(jī)制的探討研究

　　探討線粒體在熊果酸誘導(dǎo)TC-1癌細(xì)胞自噬相關(guān)性死亡中的作用。

　　方法：利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，熊果酸實(shí)驗(yàn)濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM，作用TC-1細(xì)胞24小時(shí)后，普通光鏡下觀察細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)的變化；各種濃度熊果酸分別作用1、2、3、4、5天后，采用MTT法檢測熊果酸對TC-1癌細(xì)胞增殖抑制作用；

　　利用流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜跨電位及細(xì)胞內(nèi)ATP和ROS水平變化；分光光度法檢測線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV的活性；熊果酸30μM作用TC-1細(xì)胞6小時(shí)后，在透射電鏡下檢測線粒體形態(tài)變化；熒光顯微鏡下觀察線粒體與自噬標(biāo)志蛋白LC3的位置關(guān)系。

　　結(jié)果光鏡下可見熊果酸作用24小時(shí)，10μM濃度組的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯改變，而20μM或30μM組的細(xì)胞變圓，貼壁松散，分布稀疏，及細(xì)胞兩極出現(xiàn)黑色小點(diǎn)，出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞死亡；

　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示熊果酸對TC-1癌細(xì)胞有顯著的增值抑制作用，并呈時(shí)間、劑量依賴，尤其是作用3天后，各組抑制率均達(dá)90%以上（P＜0．05）；當(dāng)熊果酸作用24小時(shí)，陰性象限熒光占總熒光的比例分別為3.1%、3.8%、6.4%、24.7%，陰性象限比例越大線粒體膜跨電位（Δψm）越低，表明Δψm隨著熊果酸作用濃度升高而降低，UA30μM組Δψm降低尤其顯著（P＜0．05）；

　　線粒體呼吸鏈復(fù)合物I、II、III和IV的活性經(jīng)熊果酸作用24小時(shí)均出現(xiàn)明顯抑制，尤其是復(fù)合酶IV（P＜0．05）；經(jīng)熊果酸作用24小時(shí)，10μM組即出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著降低；

　　熊果酸30μM分別作用0、4、8、12、24小時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平隨作用時(shí)間延長逐漸降低，呈時(shí)間依賴，并且作用4小時(shí)，與對照比ATP水平降低超過50%，12小時(shí)后，ATP水平接近0nmol/mg/protein（P＜0．05）；細(xì)胞內(nèi)ROS的水平也隨熊果酸作用濃度升高而顯著降低，熊果酸作用24小時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS陽性率分別是86.46%、82.52%、69.35%、57.24%（P＜0．05）。