甲磺酸乙酯（EMS）細胞突變誘導試劑盒產品說明書（中文版）
 
主要用途甲磺酸乙酯（EMS）細胞突變誘導試劑盒產品說明書
 
甲磺酸乙酯（EMS）細胞突變誘導試劑是一種旨在使用烷化劑甲磺酸乙酯誘導細胞發生變異而產生HPRT或TK基因功能缺失的突變株，成為篩選應用標記細胞的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于動物細胞和人體細胞。產品嚴格無菌，即到即用，性能穩定，突變頻率高。
 
技術背景甲磺酸乙酯（EMS）細胞突變誘導試劑盒產品說明書
 
甲磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate，EMS）是一種化學誘變致畸的烷化劑（alkylating agent）。它將導致細胞次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase；HPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase，TK）基因座發生位點突變，而引起基因功能缺失。由此采用6-硫氫基鳥糞嘌呤（6-thioguanine；6-TG）和5-溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxyuridine；BudR）分別篩選TK和HPRT缺失型細胞，因為6-TG是PURINES的結構替代物，而BUdR是THYMIDINE的結構類似物，當TK和HPRT正常的情況下，它們將利用6-TG和BUdR進行DNA復制而使細胞死亡，反之，它們無法利用，細胞則繼續生存。這是負向選擇。但是HPRT正常的細胞（例如正常人體細胞，其X染色體的長臂上帶有此基因）能在氨基嘌呤胸苷（hypoxanthine/aminopterin/thymidine；HAT）培養基中生長，這是正向選擇。
 
產品內容甲磺酸乙酯（EMS）細胞突變誘導試劑盒產品說明書
 
 EMS 溶液A（Reagent A）         5毫升
 EMS 溶液B（Reagent B）     5毫升
 EMS 溶液C（Reagent C）     5毫升
 EMS 溶液D（Reagent D）     5毫升
 EMS 溶液E（Reagent E）     5毫升
清理液（Reagent F）      2 X 500毫升
染色液（Reagent G）        200毫升
 TK篩選液（Reagent H）    12毫升
產品說明書              1份
 
保存方式
 
 TK篩選液（Reagent H）保存在－20℃冰箱里；清理液（Reagent F）和 EMS溶液保存在4℃冰箱里；染色液（Reagent G）保存在室溫下； EMS溶液具有毒性，注意操作安全。有效保證6月
 
用戶自備
 
25cm²細胞培養瓶：用于培養細胞的容器
75cm²細胞培養瓶：用于培養細胞的容器
 DMEM完全細胞培養基（12052）：用于細胞培養的營養基
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細胞脫離
血細胞計數器：用于細胞計量
封口膜：用于密封培養瓶后長期保存
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
臺式離心機：用于樣品離心操作
 1摩爾硫代硫酸鈉（12043）：用于EMS解毒
 
實驗步驟
 
一．確定甲磺酸乙酯（EMS）的毒力曲線
 

• 準備5瓶25cm²細胞培養瓶，并標記為1至5號試驗瓶
• 接種用戶需化學誘變的細胞
• 放進37℃細胞培養箱孵育，直到細胞生長密度達50％
• 抽去細胞培養液
• 分別加入5毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 依次加入50微升 EMS溶液A至E（Reagent A至E）到相對應的培養瓶1至5號（ EMS溶液A即1號為對照組）
• 輕輕搖勻后，放進37℃細胞培養箱孵育24小時
• 抽去培養液，分別加入5毫升用戶自備的完全細胞培養液（不含 EMS溶液）
• 放進37℃細胞培養箱孵育24小時
• 抽去培養瓶里的培養液
• 分別加入3毫升清理液（Reagent F），清洗生長中的細胞表面
• 分別抽掉3毫升清洗液
• 分別加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
• 置入37℃培養箱孵育2分種
• 輕輕抖動培養瓶，使細胞脫落
• 分別加入5毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 分別移入15毫升錐形離心管
• 在血細胞計數器上計數
• 分別移取總量為1000個細胞到5個新的25cm²細胞培養瓶，并作好對應標記
• 加入用戶自備的完全細胞培養液至總量為5毫升
• 放進細胞培養箱孵育，直至肉眼清晰可見細胞群落（1周左右）
• 小心抽去培養瓶里的培養液
• 輕輕分別加入3毫升清理液（Reagent F）到每個培養瓶里，清洗生長表面
• 小心抽去每個培養瓶里的清理液
• 分別加入2毫升的染色液（Reagent G）到每個培養瓶里，覆蓋生長表面
• 在室溫下靜置20分鐘
• 抽去染色液（Reagent G）
• 分別加入3毫升清理液（Reagent F），清洗細胞表面
• 分別抽掉清理液（Reagent F）
• 肉眼觀察并計數細胞群落
• 繪制細胞群落數和EMS濃度曲線
• 確定細胞群落數是對照組（1號培養瓶）的30％為最佳EMS誘導濃度
• 用封口膜密封培養瓶，可在室溫下長時間保存

 
二．實施甲磺酸乙酯（EMS）的細胞誘變
 

• 準備1瓶75cm²細胞培養瓶
• 接種用戶需化學誘變的細胞
• 放進37℃細胞培養箱孵育，直到細胞生長密度達50％
• 抽去細胞培養液
• 加入20毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 加入200微升誘導濃度的 EMS溶液（實驗一確定的A至E中的一種）到培養瓶（1：100）
• 輕輕搖勻后，放進37℃細胞培養箱孵育24小時
• 抽去培養液
• 分別加入20毫升用戶自備的完全細胞培養液（不含 EMS溶液）
• 放進細胞培養箱孵育24小時
• 抽去培養瓶里的培養液
• 加入5毫升清理液（Reagent F），清洗生長中的細胞表面
• 抽去5毫升清理液（Reagent F）
• 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養平面
• 置入37℃培養箱孵育3分種
• 輕輕抖動培養瓶，使細胞脫落
• 分別加入6毫升用戶自備的完全細胞培養液
• 移入到15毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入9毫升用戶自備的完全細胞培養液，充分混勻
• 平均移取3毫升到3瓶75cm²細胞培養瓶
• 每瓶分別加入17毫升用戶自備的完全細胞培養液到培養瓶里，總量為20毫升
• 每瓶分別加入200微升 TK篩選液（Reagent H），輕輕混勻
• 放進細胞培養箱里孵育2至3周
• 獲得突變細胞株（TK^-）