1.需要用戶自己準備的耗材、儀器和試劑
a.具有FAM和VIC熒光通道的熒光定量PCR儀。
b.DNase-free、RNase-free的吸頭、離心管、熒光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
c.生物安全柜。
d.RNA提取試劑盒。

2.樣本準備
a.本試劑盒適用樣本類型：上呼吸道標本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液)；下呼吸道標本(包括呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標本)；組織培養物等樣本。
b.樣本采集具體方法請參考“2019新型冠狀病毒核酸檢測專家共識”和“新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南”。
c.樣本采集后，可保存在病毒樣品常規保存液進行病毒的保存，并須當日完成檢測。否則按下述方案保存：2~8℃保存，不超過24小時；-20℃保存，不超過3個月；-70℃以下可長期保存，但應避免反復凍融。也可以使用病毒RNA穩定保存液進行保存，室溫可以保存7天左右。
d.將樣品按照病毒RNA提取試劑盒中相應的要求和步驟進行RNA提取，提取的RNA可直接用于檢測。若提取后不立即檢測，也可保存于-70℃備用，同時應盡量避免反復凍融。
e.經假病毒模擬驗證，本試劑盒也適用于保存于常規病毒保存液中的咽拭子、唾液等樣品的直接檢測，無須進行RNA的抽提。但實際操作時，須根據病毒樣本的來源、保存液類型進行一定的對比測試。對于保存在病毒RNA穩定保存液的樣品，必須進行RNA抽提后才能使用本試劑盒進行檢測。不同數量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的各種病毒保存液(TE、PBS及含FBS和抗生素的HBSS)、細胞培養液(DMEM、1640，不含FBS)、RNA病毒直接qRT-PCR保存液中，未經抽提直接使用本試劑盒進行qRT-PCR檢測的效果見下表。此處的病毒量為每個PCR反應體系中病毒的IU數。從下表數據可以看出，TE、PBS及常用的細胞培養液中保存的假病毒可以直接用于本試劑盒檢測，而 RNA病毒直接qRT-PCR保存液效果更佳。含有FBS的HBSS可能由于FBS的影響，Ct值會高出約2-3。

f.核酸檢測的各個步驟需要在指定區域進行，以避免交叉污染。例如樣本處理、加樣在樣本處理區，擴增試劑準備在PCR前準備區，核酸擴增在檢測區。

3.qRT-PCR反應體系的設置
a.融解并混勻反應所需的各種溶液，置于冰浴上或冰盒內。
參考下表在室溫或冰浴上設置qRT-PCR反應體系(以96孔板，每孔反應體系為25µl為例)。下表中的Template RNA為樣品RNA、試劑盒中提供的Negative Control或Positive Control。建議每次檢測都設置陰性對照(Negative control)和陽性對照(Positive control)。

*注：實際操作時，如果經驗證測試可免RNA抽提而直接檢測，則用RNA病毒樣本直接替代Template RNA。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。
d.將設置好的PCR反應管或PCR反應板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應。
e.熒光檢測通道的選擇：ORF1ab基因熒光基團是VIC，可選擇檢測通道(Reporter)為VIC/HEX/JOE，淬滅基團(Quencher)是BHQ1，如果沒有BHQ1，則選擇無；N基因熒光基團是FAM，可選擇檢測通道為FAM，淬滅基團是TAMRA，如果沒有TAMRA，則選擇無。請將儀器的熒光內參設置為“None”，例如：對于ABI系列儀器，將“Passive Reference”設置為“None”。

4.qRT-PCR反應程序
本試劑盒建議采用如下的qRT-PCR程序，本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex熒光定量PCR儀為例：
a.反轉錄：50℃ 20min
b.預變性：95℃ 2min
c.變性：95℃ 15sec
d.退火/延伸：60℃ 20sec
e.重復步驟c和步驟d，總共45個循環
f.最后使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析檢測結果。

5.結果的定性判斷
a.陽性對照：呈典型S型擴增曲線且Ct值≤33。
b.陰性對照：無典型S型擴增曲線或Ct值>38。
c.陽性：如果待測樣本檢測結果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35，則可判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性。
d.陰性：如果兩個通道檢測Ct值無數值或Ct值>38，且陽性對照品檢測結果為陽性，此次結果判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性，但不排除其它冠狀病毒感染的可能。
e.可疑：如果待測樣本35<Ct值≤38，則此樣本應重新提取核酸后再次進行檢測。如重復檢測結果顯示兩個通道Ct值均≤35，則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陽性；如兩個通道檢測Ct值無數值或Ct值>38，則判斷為新冠狀病毒(2019-nCoV)核酸陰性；如其中任一通道35<Ct值≤38，則該樣本為可疑樣本，應通過其它方法如測序進行進一步的分析和檢測。