作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷倫科技有限公司

​​摘要
Agilent Femto Pulse 系統采用革命性設計，是唯一一款能夠自動進行高分子量 (HMW) gDNA 脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 分析的儀器。與傳統 PFGE 分析相比，Femto Pulse 系統能夠在更短時間內對 gDNA 分子量和完整性進行定性分析。應用領域涵蓋三代測序或長讀長測序平臺的小基因組分析到復雜基因組從頭組裝，這些應用要求 HMW gDNA 樣品滿足高質量標準。有多種方法針對特定的下游應用從選取的真核和原核來源樣品中分離 gDNA。而分離 gDNA   的分子量和質量會受到不同提取方法的影響，因此需要對 gDNA 樣品進行可靠的質量評估。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒專為 Femto Pulse 系統上的 HMW gDNA 分離而設計，可提供準確而重現的分子量和質量評估。利用基因組 DNA 165 kb 分析試劑盒在 Femto Pulse 系統上對比五種不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和質量。

前言
大片段基因組文庫（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和 PacBio Technologies 的文庫）需要起始基因組 DNA (gDNA) 滿足特定質量條件才能成功獲得結果。影響樣品質量的幾個因素包括：提取方法、樣品儲存、反復凍融循環和變性^[1]。在提取和處理 gDNA  期間，DNA  可以在許多不同環節發生物理、酶促和化學剪切，變為小片段。因此，準確可靠的 gDNA 質量評估對于這些下游測序過程的成功至關重要。通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評估 gDNA 質量。過夜脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 通常用于評估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配備基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統是市面上唯一一款用自動分離系統替代 PFGE 的解決方案，可在短短 70 分鐘內評估 HMW gDNA。

實驗部分
將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株 BY4741（ Dharmacon，部件號YSC1048）在 YPD 肉湯培養基（賽默飛世爾科技公司，部件號 A1374501）中培養 24 小時。離心收集細胞，再按照若干種方案提取 gDNA。方法 A 采用經典的苯酚-氯仿-異戊醇 (25:24:1)（賽默飛世爾科技公司，部件號 AC327111000）提取方案^[2]，方法 B、C、D、E 根據以下四種不同市售試劑盒的制造商說明書進行：

Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega Life Sciences，部件號 A1120）、Quick- DNA 通用試劑盒（Zymo Research，部件號 D4068T）、MegaLong gDNA 試劑盒（G-Biosciences，部件號 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因組 DNA 緩沖液組合（Qiagen，部件號 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和 E 是離心柱提取，方法 D 是膜提取。分別通過 PFGE 以及在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒（部件號 Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系統（部件號FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 擴展 gDNA 165 kb 法（擴展法），對提取的 gDNA 進行分離。在 Femto Pulse 系統操作軟件中選擇基因組 DNA 165 kb 快速和擴展法。將 50 ng/µL 左右 gDNA上樣至 0.8% 瓊脂糖凝膠（Lonza SeaKem Agarose，部件號 50152），并用 Pippin- Pulse 預設方案（ 5 至 150 kb）通過PFGE 分離 18 小時 (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量標準品（165、50、42、23、21、17.7、10   kb）（部件號 FP-7002-U035）和低范圍 PFG 標準品（New England Biolabs，部件號N0350S）。分離后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件號 FP-6001-U030）對瓊脂糖凝膠進行后染色，并用紫外透照儀觀察。

結果與討論
在 Femto Pulse 系統上用快速和擴展基因組 DNA 165 kb 方法測定分子量分布
Femto Pulse 系統軟件為基因組 DNA165 kb 試劑盒提供了兩種分離方法。快速法是一種 70 分鐘的脈沖場毛細管電泳 (CE) 分離，最適合對 80 kb 以下的 gDNA 樣品進行分離與分子量測定。擴展法采用另一種持續 3.5 小時的脈沖場 CE 分離方法，專用于改善大于 80 kb 的 gDNA 樣品的分離和分子量測定。用快速法分離的大于 80 kb 的基因組 DNA 峰形尖銳、緊湊，與 165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似^[3]。導致這一結果的部分原因為脈沖場分離期間用于樣品分離的時間太短。擴展法在更長的分離時間中使用了脈沖場 CE 替代方法，并將相同 gDNA 樣品分離為更寬的彌散條帶，更能代表樣品的整體分子量范圍。擴展法推薦用于大于 80 kb 的 gDNA 樣品（快速法僅能將其分離為 165 kb 左右的緊湊峰）。



Femto Pulse 系統使用基因組 DNA 165 kb擴展法來分離大于 80 kb 的提取 gDNA（圖 1）。使用 Agilent ProSize 數據分析軟件上的 Smear Analysis 選項卡分析 gDNA 的分子量分布。彌散條帶分子量分布包含整個彌散條帶范圍內的濃度分布。酵母 gDNA 的彌散條帶分子量分布和完整性隨使用的提取方法不同而變化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因組 DNA 樣品的彌散條帶分子量依次減小（表 1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 彌散條帶。用傳統液體苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因組 DNA 產生的完整 gDNA 較長，平均為163670 bp，而另一種液相提取方法 B 為
103111 bp。方法 C 離心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五種不同提取方法中表現出相似的彌散條帶分子量分布結果。



在使用基因組 DNA 165 kb 擴展法分析時，方法 E 離心柱 gDNA 提取方法得到的電泳圖顯示整個 gDNA 樣品均分子量小于 80 kb。因此，將使用快速法和擴展法分析的方法 E 樣品進行對比（圖 2）。兩種方法對樣品 E 得到的彌散條帶分子量相近，為 30579 和 27388 bp（分別對應于快速法和擴展法）。在此示例中， 1 小時的快速法運行時間更短，故優于擴展法。



Femto Pulse 系統與脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 的對比
過去，16 至 18 小時的 PFGE 分析是測定 50 kb 以上 gDNA 質量和分子量的唯一選擇。隨著技術的進步，Femto Pulse 系統成為唯一一款能夠在短短 70 分鐘內評估 165 kb 以內 gDNA 分子量和質量的儀器。用 Femto Pulse 系統取代過夜運行的 PFGE，省去了數天專門用于質量控制檢查的時間，從而節省了時間和金錢。ProSize 數據分析軟件自動提供峰分子量、電泳圖和數字化膠圖，實現樣品質量和分子量的快速測定。相比之下，PFGE 運行需要采用額外軟件進行用戶評估，以獲得計算分子量值。此外，Femto  Pulse 系統將樣品起始量降至皮克級，節省了寶貴的樣品材料。
 
對于測試的所有提取方法，Femto Pulse 系統擴展法與 PFGE 凝膠得到的 ProSize 數字化膠圖中的 gDNA 濃縮條帶區域具有相近的分子量（圖 3）。Femto Pulse 系統的高靈敏度使其能夠檢出因濃度低而無法在 PFGE 上檢出的完整 gDNA 彌散條帶范圍。此外，Femto Pulse 系統的出色分
辨率有助于區分用方法 B、C、D 提取的分子量相近的gDNA 樣品。

基因組質量值 (GQN)
提取 DNA 的質量會因為提取方法、樣品處理和組織類型的不同產生很大差異。因此，在使用樣品前通過質量控制分析來確定高度完整的 gDNA 十分重要。基因組質量值 (GQN) 專為 ProSize 設計，可以輕松
實現定制化的 gDNA 質量評估。用戶可針對其特定應用設定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據高于指定分子量閾值的總測量濃度分數計算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級對樣品進行評分，0 表示樣品均未超過閾值，10 表示 100% 的樣品高于閾值。

在需要分析不同分子量的 gDNA 時，能設置可自定義的 GQN 分子量閾值是一項巨大的優勢。用戶可以根據具體樣品確定合適的分子量閾值，以便客觀判斷哪些樣品可滿足用戶要求。將方法 A、B、C、D、
E 提取的酵母 gDNA 的 GQN 分子量閾值設為 50 kb。隨著 gDNA 樣品分子量的減小，GQN 分別為 8.2、7.4、6.1、3.0、1.1（分別對應于方法 A、B、C、D、E， 表 1），與預期相同。GQN 還表示高于分子量閾值的樣品百分比。例如，GQN 8.2 表示高于 50 kb 閾值的樣品占 82%。也就是說，有 18% 的樣品低于閾值。方法C 和 D 得到的分子量相近（分別為 77 和 62 kb），但得到的 GQN 分別為 6.1 和
3.0，差異很大。GQN 所反映出的差異主要是由于彌散條帶分布不同，因此相近平均分子量的 gDNA 的質量水平不同。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應用的樣品時，需要同時考慮樣品的分子量和質量。

結論
Agilent Femto Pulse 系統是唯一能夠替代 HMW gDNA 過夜 PFGE 分析的自動化系統，可以在 70 分鐘內完成分析，大大節省時間和金錢。此外，Femto Pulse 系統將樣品起始量降至皮克級，節省了寶貴的樣品材料。Agilent ProSize 數據分析軟件能夠報告用戶定義的 GQN 質量評分，該評分客觀代表了每個樣品中 HMW gDNA 的百分比。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應用的樣品時，同時需要考慮樣品分子量和質量。使用 Femto Pulse 系統和安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒對比了通過不同方法提取的 DNA 樣品的分子量和質量。與其他液相、離心柱和膜提取方法相比，傳統酚-氯仿提取方法得到的 gDNA 最長且最完整。Femto Pulse 系統具有極高的分辨率，可以區分平均分子量相近的 gDNA 樣品間的不同分子量分布，這是傳統PFGE 無法實現的功能。

參考文獻
<sup>1. Pocernich, C.; Uthe J.; Wong K-S. Quality Assessment of Genomic DNA for Biobanking Samples（用于生物樣本庫樣品的基因組 DNA 質量評估），安捷倫科技公司應用簡報， 出版號 5994-0520ZHCN，2018
2. Fan, H.; Gulley, M. L. DNA Extraction from Fresh or Frozen Tissues.In Methods in Molecular Medicine: Molecular Pathology Protocols, Killeen, A. A., Ed.; Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001; vol. 49, pp 5–10
3. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing andQuality Control on the Agilent FemtoPulse System（在 Agilent FemtoPulse 系統上進行基因組 DNA 分子量測定與質量控制），安捷倫科技公司應用簡報，出版號 5994-0516EN，2017


僅限研究使用。不可用于診斷目的。
本文中的信息、說明和指標如有變更，恕不另行通知。
2019 年 3 月 5 日，中國出版
© 安捷倫科技（中國）有限公司，2019
5994-0754ZHCN</sup>