敞開式離子化質譜技術在中草藥研究中的應用
中國微生物菌種查詢網  敞開式離子化質譜(ambient ionization mass spectrometry，AIMS)是近年來興起的一種無需(或稍許)樣品前處理步驟，在敞開的大氣環境下實現離子化的質譜分析技術。近年來，各種AIMS技術的研制與應用成為質譜領域備受關注的焦點之一。本工作綜述了AIMS技術在中草藥研究中的應用，對典型的分析策略進行了討論，闡述了AIMS技術的基本原理、特點和分類，并展望了該技術在中醫藥研究領域未來發展的趨勢和可能的影響.

 敞開式離子化質譜(ambient ionization mass spectrometry，AIMS)是一種能在敞開的常壓環境下直接對樣品或樣品表面物質進行分析的新型質譜技術，此技術無需(或者只需簡單的)樣品前處理，便可實現對樣品的分析，具有實時、原位、高通量、簡便快速、環保、可以與各種質譜儀器聯用等一系列優點，同時兼具傳統質譜的高分析速度、高靈敏度等特點。2004年Cooks課題組在電噴霧電離基礎上首次提出解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)技術。2005年Cody等在大氣壓化學電離基礎上研制出實時直接檢測的DART(Direct analysis in real time)技術;幾乎同時，謝建臺等也研制出類似的電噴霧輔助激光解吸電離質譜技術。繼而，AIMS的研發引起了廣泛關注，各類新技術不斷涌現，目前AIMS技術的種類已有40余種。為促進AIMS技術的創新和發展，由中國質譜學會和華質泰科生物技術(北京)有限公司共同主辦的AIMS國際學術年會從2013年至今已經成功舉辦4次，引領著AIMS技術迅速向各個行業逐層滲透，深深地影響著下一代分析檢測技術的開發和利用。與經典的電噴霧、大氣壓化學電離和大氣壓光電離等電離方式相比，AIMS具有溶劑消耗少、更強的耐鹽和抗基質干擾能力，同時，AIMS的敞開結構和模塊化設計使其可以方便的與各種質譜連接，從而大大降低了儀器購置成本。這一技術在醫學、藥學、食品安全、環境污染物監控、爆炸物檢測、生物分子及代謝物表征、分子成像等諸多領域已展現出廣泛的應用前景。因此，AIMS的基礎和應用研究備受質譜學家的關注，基礎研究主要圍繞構建開發新型的AIMS離子源，探究研究相應的離子化機理;應用研究主要是對各種實際樣品進行定性和定量分析。本工作著重綜述AIMS在中草藥研究中的應用，通過對典型的分析策略進行討論，闡述AIMS技術的基本原理、特點和分類，并展望該技術在中醫藥研究領域未來發展的可能趨勢和影響。
 
⒈敞開式離子化質譜技術的基本原理、特點和分類
AIMS集成了樣品原位解吸附、待測物實時離子化和離子傳輸至質量分析器三個核心步驟。下面，以DART為例，介紹離子化的基本原理：利用He或者N2作為工作氣通過放電室，放電室內部的陰極和陽極之間施加一個高達幾千伏的電壓導致高壓輝光放電，使工作氣電離成為含激發態氣體原子或分子、離子、電子的等離子體氣流。等離子體氣流流經圓盤電極，選擇性地移除某些離子后被加熱，加熱等離子體氣流從DART口噴出至樣品表面，完成熱輔助的解吸附和離子化過程。離子化機理一般認為包括周圍氣體被激發態工作氣體的彭寧(Penning)電離、進而發生的質子轉移以及其他類型氣相離子分子反應等過程。AIMS技術不僅可在常壓下對待測樣品離子化，而且離子源的敞開結構易于實現物體表面的直接離子化及質譜分析。這類離子源操作簡便、快捷，無需復雜的樣品前處理。AIMS技術的另一重要特征是快速及高通量，通常每個樣品的分析時間不超過5s，充分展現了質譜快速分析的優勢，為高通量分析提供了一種新的有效途徑。因此，常壓敞開式離子源開辟了質譜技術在無需樣品前處理的直接、快速分析，表面與原位分析等領域的廣闊應用領域。
 
AIMS離子源按照其離子化過程和機理可以分為三大類：1)直接電離離子源。樣品直接進入高電場被電離，如，在ESI源基礎上發展起來的眾多離子源，包括直接電噴霧探針(Direct electrospray probe ionization，DEPI)、探針電噴霧電離(Probe electrospray ionization，PESI)、紙噴霧電離(Paper spray ionization，PSI)、場致液滴電離(Field induced droplet ionization，FIDI)和超聲波電離(Ultra-sound ionization，USI)等;2)直接解吸電離離子源，同時起到對樣品解吸和電離的作用。包括解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)、電場輔助解吸電噴霧電離(Electrode-assisted desorption electrospray ionization，EADESI)、簡易敞開式聲波噴霧電離(Easy ambient sonic spray ionization，EASI)、解吸大氣壓化學電離(Desorption atmospheric pressure chemical ionization，DAPCI)、介質阻擋放電電離(Dielectric barrier discharge ionization，DBDI)、等離子體輔助解吸電離(Plasma-assisted desorption ionization,PADI)、大氣壓輝光放電電離(Atmospheric glow discharge ionization,APGDI)、解吸電暈束電離(Desorption corona beam ionization,DCBI)、激光噴霧電離(Laser spray ionization,LSI)等;3)解吸后電離離子源。這是一種兩步機理離子源,第1步先對被分析物進行解吸附,第2步實現被分析物的電離過程,包括氣相色譜-電噴霧質譜(Gas chromatography electrospray ionization,GC-ESI)、二次電噴霧電離(Secondary electrospray ionization,SESI)、熔融液滴電噴霧電離(Fused droplet electrospray ionization,FD-ESI)、萃取電噴霧電離(Extractive electrospray ionization,EESI)、液體表面彭寧電離質譜(Liquidsurface Penning ionization,LPI)、大氣壓彭寧電離(Atmospheric pressure Penning ionization,APPeI)、電噴霧激光解吸電離(Electrospray laser desorption ionization,ELDI)、基質輔助激光解吸電噴霧電離(Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization,MALDESI)、激光消融電噴霧電離(Laser ablation electrospray ionization,LAESI)、紅外激光輔助解吸電噴霧電離(Infrared laser-assisted desorption electrospray ionization,IR-LADESI)、激光電噴霧電離(Laser electrospray ionization,LESI)、激光解吸噴霧后離子化(Laser desorption spray post-ionization,LDSPI)、激光誘導聲波解吸電噴霧電離(Laser-induced acoustic desorption electrospray ionization,LIAD-ESI)、激光解吸-大氣壓化學電離(Laser desorption-atmospheric pressure chemical ionization,LD-APCI)、激光二極管熱解吸電離(Laser diode thermal desorption,LDTD)、電噴霧輔助熱解吸電離(Electrospray-assisted pyrolysis ionization,ESA-Py)、大氣壓熱解吸-電噴霧電離(Atmospheric pressure thermal desorption-electrospray ionization,AP-TD/ESI)、基于熱解吸敞開式電離(Thermal desorption-based ambient ionization,TDAI)、大氣壓固態分析探針(Atmosphericpressure solids analysis probe,ASAP)、實時直接分析(Direct analysis in real time,DART)、解吸大氣壓光致電離(Desorption atmospheric pressure photoionization,DAPPI)等。
 
⒉敞開式離子化質譜技術在中草藥研究中的應用
建立一種新的方法,能夠對中草藥中的藥效成分和雜質進行分析,這對于中草藥的質量評價和質量控制有重要意義。敞開式離子化質譜技術的發展為中草藥分析提供了一種快速、直接的手段。本文綜述了不同類型敞開式離子化質譜在中草藥分析中的應用,并對典型分析案例加以討論。
⑴直接電離離子源
直接電離離子源是基于電噴霧原理的直接電離敞開式離子化質譜技術,將樣品組織中分析物直接電離進行質譜分析。這項技術快速、直接、實時、原位,無需樣品前處理,適用于中藥材直接分析。主要應用技術包括：直接電離(Direct ionization)、組織噴霧電離(Tissue spray)、葉片噴霧(Leaf spray)、直接植物噴霧(Direct plant spray)場致直接電離(Field-induced DI)、內部萃取電噴霧電離(Internal extractive electrospray ionization mass spectrometry,iEESI)等。雖然這些技術的名稱不同,但它們的原理和分析策略是相似的,即,將樣品本身作為固體基質,應用溶劑和高電壓使分析物溶解或萃取到溶劑中,液相分析物分子在高電場作用下直接電離、噴霧、產生帶電液滴和離子進行質譜分析。
姚鐘平課題組在固體基質下的電噴霧離子化機理與應用方面做了大量的研究工作。固體基質電噴霧電離是將中草藥的粉末、混懸液、提取液附著于固體基質上用于直接電離分析,可用的固體基質包括：純金屬探針、紙三角、木片、鋁箔、移液器頭等。因鋁箔具有惰性、不滲透性、相對剛性等特點,可以折疊承載溶劑,對粉末樣品有目的性的提取,在敞開式的環境下進行電噴霧質譜分析。鋁箔電噴霧質譜已經成功應用于西洋參和附子等中藥粉末樣品中主要成分的測定。移液器頭模式的分析是將移液器頭與質譜進樣器和進樣泵連接,在線提取進樣器頭中的中藥粉末,加以高電壓使帶電有機溶劑通過中藥粉末將分析物提取出來后電離,經由質譜分析。這種移液器頭模式的分析已成功應用于人參、西洋參和三七中皂苷類成分、南、北五味子中木脂素類成分和多種藥材中生物堿類成分的測定。
⑵直接解吸電離離子源
自DESI問世以來，其在中草藥分析中的應用已被陸續報道。采用的主要方式包括：分析物的表面解吸電離、反應直接解吸電離、分析物的表面成像、薄層色譜與直接解吸電離質譜聯用等，其中應用最廣泛的是分析物的表面解吸電離，無需中藥材樣品的前處理，可直接分析。
DAPCI是應用大氣壓電暈放電從化學試劑中產生電子、質子、亞穩態原子、水合氫離子和質子化溶劑離子，去解吸電離樣品表面的分析物，進行質譜分析，主要用于分析低分子質量的揮發性或半揮發性化合物。已報道的研究有南、北五味子中萜品烯類成分和人參、紅參中皂苷類成分的分析。
DCBI是將高直流電壓加在尖針上引發氦原子電暈放電，在電暈針附近產生激發態離子，與分析物在樣品表面發生反應，產生單電荷分析物離子，進行質譜分析。應用DCBI分析中草藥中低極性成分是極具挑戰性的。為了解決這一難點，文獻報道了一種設計方案，將反應試劑(飽和氫氧化鈉與甲醇溶液，3:7，V/V)加入樣品中以提高DCBI的電離效率，并將該方法成功應用于6種中藥材中生物堿的測定，并將其與TLC聯用測定生物堿的含量。
⑶解吸后電離離子源
DART-MS是在中草藥分析中應用較為廣泛的一種敞開式離子化質譜技術，其離子源目前已有商品化的產品。DART-MS的主要分析策略包括：分析物的表面解吸電離，將樣品置于DART源與質譜進口;粉末樣品的分析，將填充樣品的玻璃毛細管(棒)置于DART源加熱的氣體束中電離;液態樣品分析，將樣品滴在熔點管(浸管)、金屬篩網(不銹鋼金屬網格)上面，置于DART源與質譜進口之間;TLC與DART-MS聯用分析，是將化合物在薄層板上分離后，將薄層板置于DART源與質譜進口之間，分析物經加熱氣體的熱解吸附，通過離子-分子反應使分析物電離再引入質譜進行分析。
EESI和nano-EESI是基于電噴霧電離的敞開式離子化質譜技術，發明最初主要被應用于液態和氣態樣品分析，被分析物從溶液相或氣相樣品中被萃取出來，經由電噴霧電離產生離子進行質譜分析。陳煥文課題組將Nano-EESI-MS技術成功應用于人參中人參皂苷的測定。將激光解吸或消融與電噴霧結合的敞開式離子化技術(LAESI)適用于固體樣品分析，在中草藥分析中的應用主要有：孔雀草根、莖、葉中的成分分析和鼠尾草葉中萜類成分的測定。將敞開式離子化技術與光致電離原理相結合，應用于中草藥研究中，主要有兩種方式：解吸大氣壓化學電離(DAPPI)和激光消融大氣壓光致電離(LAAPPI)。這兩種方式可以使樣品表面非極性和中性分析物有效電離進行質譜分析，另外，這兩種方式還具有表面成像功能，例如，DAPPI-MS和LAAPPI-MS技術在鼠尾草葉成分表面成像研究中的應用，以及枳殼葉中主要藥效成分的DAPPI-MS分析等。等離子體輔助激光解吸質譜(PALDI-MS)已被成功用來研究黃芩中黃芩素和漢黃芩素成像，結果顯示，此成分集中分布于根的表皮維管束邊緣。
⑷在中草藥質量評價和質量控制中的應用
隨著敞開式離子化質譜技術的不斷發展，其在中草藥質量快速評價和控制中的應用日益廣泛。敞開式離子化質譜指紋分析方法能夠給出中草藥成分的整體化學輪廓，可用于評價中草藥質量的穩定性、追溯基源、鑒別真偽。應用敞開式離子化質譜方法評價和控制中草藥質量，首先要選擇一種適合的敞開式離子化技術，建立指紋圖譜分析方法，進而對樣品進行分析，將獲得的數據采用多變量統計分析方法處理，例如主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、聚類分析(HCA)等。
目前，應用DART-MS技術結合多種統計分析方法，成功區分了蔞葉的不同栽培品種;區分了曼陀羅、蘿芙木、蓽澄茄以及傘形科中藥的不同品種，并鑒定了其中標志性化學成分;區分了不同來源的當歸;鑒定了川烏中標志性化學成分，并區分了其炮制程度的不同。將DAPCI-MS技術結合PCA分析應用于南、北五味子研究，成功區分了不同栽培品種和野生品種，并區分了不同炮制品種。應用Wooden-tipESI-MS結合PCA和PLS-DA技術，鑒定了川貝母粉末的品種，并區分了其中摻偽品。
⑸本實驗室的研究工作
中藥成分的確認和定量分析是近年來AIMS的重要發展方向之一，本實驗室選用商品化的DART為離子源，開發的方法具有較強的可重復性和實際應用價值。研究內容主要包括5個方面。
①中藥的快速分析：研究了8種中藥的化學成分，實現了生物堿類、黃酮類和部分人參皂苷的快速、直接分析;并對DART的電離機制進行了較深入的討論;
②中藥成分的DART定量分析：針對中藥延胡索的功效成分延胡索甲素和乙素進行DART定量分析，利用甲基化衍生和氘代內標實現了人參皂苷的DART定量分析;
③對DART技術不易電離成分的分析：本實驗室首次采用瞬時衍生化試劑四甲基氫氧化銨對皂苷和寡糖類成分進行DART源內的瞬時甲基化，通過甲基化衍生增加皂苷成分的揮發性，生成銨加合物離子，實現了多羥基化合物(如人參皂苷和寡糖)的DART分析檢測。其中，四甲基氫氧化銨不僅發揮了衍生化的作用，同時還作為輔助電離試劑增強了皂苷成分在DART中的靈敏度[62]。因為該反應屬于自由基反應，反應控制難度較大，重復性還有待提高;
④DART用于農藥殘留的檢測：針對100余種農殘成分開展了DART快速檢測研究，發現多種農藥成分在DART電離過程中不僅有加合離子(離子-分子反應產物)，還產生碎片(過剩能量產生)，此外，實驗發現有機磷農藥會發生氧硫交換的氧化反應，并對其反應機制進行了深入探討;
⑤開展DART電離機理研究：研究發現，不同的工作氣體(氦氣、氬氣、氮氣等)因其不同的電離能和氮氣的振動自由度影響，使得其在電離過程中展現出不同的特性，雖然氦氣因具有更高的電離能應用范圍更廣，但是在某些場合下使用電離能較低的氬氣和氮氣(較氦氣價格低廉)產生的待測化合物碎片較少，再適當引入輔助(make up)試劑可有效地提高待測物的靈敏度。經過研究發現，具有較低電離能的氟苯和丙酮等作為輔助試劑能明顯的提高待測物的分析靈敏度。
 
⒊總結與展望
中藥品質的安全有效主要取決于其中所含的藥效成分和雜質，這就要求應用快速、可靠的分析方法來評價和控制中藥材的質量。目前，多種敞開式離子化質譜技術已成功應用于多種中藥中多種類型化學成分的檢測，并可對多種中藥的品質進行綜合評價和質量控制。一般來講，對于揮發性較好或質子親合能較高的成分，如生物堿，黃酮類等成分，電離可以直接發生在植物組織表面附近而不需借助溶劑和其他基質。為了得到好的分析結果，對于皂苷類等組分需溶劑輔助，對于糖類組分的分析甚至需要簡單的衍生化。敞開離子化源，其原理之一是被分析物周圍的氣相離子-分子反應，這些反應很難達到經典的密閉CI源平衡條件，因此，在實驗條件控制，數據的重復性方面還存在一些困難，尚需技術本身不斷完善。另外，對分析物的準確定量方法也有待開發及改進。以上這些問題需要分析化學家和質譜學家的持續關注和潛心研究，相信在不遠的將來，敞開式離子化技術與小型質譜儀器結合的分析方法能應用于中藥生產的田間地頭、成品藥生產線、中醫診斷的輔助等更多的中醫藥領域，為推動傳統中醫藥的現代發展發揮更大的作用。