植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)測定試劑盒說明書
產品組成：植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)測定試劑盒
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組分貨號 |
名稱 |
規格 |
貯存 |
運輸 |
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RTU4062-01 |
試劑1-PEPCase提取緩沖液（2×） |
100 ml |
短期4℃，長期-20℃ |
常溫 |
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RTU4062-02 |
試劑2-PEPCase Assay buffer(10×) |
15 ml |
短期4℃，長期-20℃ |
常溫 |
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RTU4062-03 |
試劑3-PEP（100×） |
1 ml |
-20℃ |
常溫 |
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RTU4062-04 |
試劑4-NADH（100×） |
1.2 ml |
-20℃ |
常溫 |
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RTU4062-05 |
試劑5-MDH（100×） |
2 KU |
-20℃ |
常溫 |
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RTU4062-06 |
試劑6-酶溶解緩沖液 |
5 ml |
-20℃ |
常溫 |
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BSA-02 |
試劑7-BSA溶液 50mg/ml |
5 ml |
-20℃ |
常溫 |
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DT0140P |
試劑8-1MDTT（100×） |
1 ml |
-20℃ |
常溫 |
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DE005 |
試劑9-滅菌水 |
100 ml |
4℃ |
常溫 |
● 產品簡介：
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的關鍵酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應生成草酰乙酸，在植物和細菌中廣泛存在，在動物及絲狀霉菌中缺乏此酶。此酶是變構酶，主要功能為三羧酸循環提供草酰乙酸， 另外也與 C4 植物光合二氧化碳固定反應及景天科植物的蘋果酸形成 (景天酸代謝 )等有關。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)檢測試劑盒檢測原理如下：在弱堿條件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在蘋果酸脫氫酶(MDH)催化下被 NADH 還原為蘋果酸 (Mal) 。在堿性條件下每吸收 1 分子 CO2伴隨 1 分子 NADH 氧化，通過分光光度計測定處吸光度的變化，計算出 NADH 的消耗速率，進一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
該試劑盒主要用于檢測植物樣本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取緩沖液計算，試劑盒可以使用100次。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設備；1ml石英比色皿；紫外分光光度計；制冰機；低溫離心機
● 操作步驟：
一、 即用型PEPCase提取緩沖液配制：
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一個反應配制體積 |
n個反應配制體積 |
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1 ml |
n×1 ml |
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PEPCase提取緩沖液（2×） |
500 μl |
n×500μl |
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滅菌水 |
470 μl |
n×470 μl |
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1 M DTT（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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BSA溶液50mg/ml |
20 μl |
n×20μl |
注：1. 即用型PEPCase提取緩沖液盡量現配現用，短期4℃中可以過夜保存。
二、 PEPCase樣品提取：
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大小）或0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 5分鐘，上清即為PEPCase提取液，冰浴放置備用。
注：提取液最好立即測定，不建議保存。
三、PEPCase活性測定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標簽所示，在試劑6-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-PEP：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
3. 試劑4-NADH：按照標簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長期-80℃保存。
4. 試劑5-MDH：按照標簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，徹底混勻后冰浴備用。
5. 反應體系設定：
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加入順序 |
組份 |
1ml反應體系加入量 （測定1個樣品） |
MasterMix配制 （測定n個樣品為例） |
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1 |
10×PEPCase Assay Buffer |
100 μl |
n×100 μl |
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2 |
滅菌水 |
870 μl |
n×870 μl |
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3 |
NADH溶液（100×） |
10 μl |
n×10μl |
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4 |
PEP溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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5 |
MDH溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
5. 反應體系測定；
1.5 ml離心管中配制以下反應
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1 |
2 |
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對照反應 |
樣品活性測定 |
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MasterMix |
975 μl |
975 μl |
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即用型PEPCase提取緩沖液（步驟一） |
25 μl |
- |
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PEPCase樣品提取液 （步驟二） |
- |
25μl |
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混勻后加入到1 ml比色皿中，立即計時，此時吸光度為A0，每隔 10s 測定一次吸光度，其中至 1min 時處吸光度記為A1，記錄其變化。 |
注意： = 1 \* GB3 ① 一般分光光度計OD340讀數在0.5-3之間數據比較準確，低于此范圍說明提取用的材料太少，酶活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，酶活性太高，此時可以將PEPCase樣品提取液用即用型PEPCase提取緩沖液稀釋后測定。
= 2 \* GB3 ② 該反應系統是利用速率變化，求得相應 OD 的變化，進而推算出 NADH 的消耗速率，再進一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase樣品提取液后立即計時很重要，每次檢測指標不宜過多，否則有可能由于操作時間有差異進而導致結果偏差。
四、PEPCase活性計算：
根據如下公式計算樣品中PEPCase活性：
1. 根據葉片面積的計算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數
d-cm 比色皿光程，一般為1 △t-秒 測定時間，本程序為60秒 S-cm2 提取時使用的葉面積
2. 根據葉片鮮重的計算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=
Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鮮重葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應最初1分鐘內340nm處測定管吸光度變化的絕對值，△A=A0-A1
N-稀釋倍數，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測定時間，本程序為60秒
g- 提取時使用的葉片鮮重
