氧化型谷胱甘肽含量測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GSH/GSSG 是細胞內最重要的氧化還原對之一。因此，測定細胞內 GSH 和 GSSG 含量以及

GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態，也是谷胱甘肽氧化還原循環的主要指標之一。

測定原理：

利用 2-VP 法測 GSSG 含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：液體 150μL×1 支，4℃保存。
試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 2.5mL×1 瓶，4℃保存。
試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 20 mL 試劑三溶解，現配現用。
試劑六：液體 15μL×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 0.3mL 試劑三稀釋，4℃保存。

粗酶液提取：

1.組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清液（如上清不清澈，再離心 3min）待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；8000g 4℃離心 10min，取上清液（如上清不清澈，再離心 3min）混勻待測。

3. 血清等液體：直接測定。

GSSG 含量測定：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30min，調節波長到 412nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）水浴中保溫 30min。

3. 測定管：取 1 mL EP 管，加入 20μ L 上清液，1 μ L 試劑二，蓋緊后混勻，置于 37℃水浴30min；開蓋后依次加入 20 μ L 試劑四，140 μ L 試劑五，2 μ L 試劑六，迅速混勻后，測定30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，計算ΔA=A2-A1。

GSSG 含量計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為 y=0.0325x+0.046；x 為標準品濃度（nmol/mL），y 為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)

=30.77×(ΔA-0.046)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)

=30.77×(ΔA-0.046)÷W

4、按細胞數量計算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)

=30.77×(ΔA-0.046)÷細胞數量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA-0.046)÷0.0325×V 樣÷V 樣

=30.77×(ΔA-0.046)

V 樣：反應中加入樣本體積，20μL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質量，g，

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

1、標準條件下測定的回歸方程為 y=0.016x+0.023；x 為標準品濃度（nmol/mL），y 為吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白濃度計算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)

=61.54×(ΔA-0.023)÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

GSSG（nmol /g 鮮重）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)

=61.54×(ΔA0.023)÷W

4、按細胞數量計算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)

=61.54×(ΔA-0.023)÷細胞數量

5、按照液體體積計算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA-0.023)÷0.016×V 樣÷V 樣

=61.54×(ΔA-0.023)

V 樣：反應中加入樣本體積，20μL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質量，g，

Cpr：樣本蛋白濃度（mg/mL）

注意事項：

1. 提取過程中去掉蛋白質，所以提取液不能用于測定蛋白含量。

2. 臨用前配制的試劑配好后 4℃保存，2 天內使用完畢。

3. 最低檢出限為 0.1μmol/L。

4. 反應溫度.嚴格來說，為保證重復性，應在 25℃下進行反應。

5. 反應時間需精確控制，否則會影響反應速率計算，產生較大誤差。

6. 樣品中的 GSSG 濃度盡可能低一些，否則反應速率太大，沒法控制，所以稀釋倍數要盡量大些。