核酸鑒定方法之濃度/純度及完整性鑒定

瀏覽次數：19435　發布日期：2017-6-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

文/韓英
編輯/Bruce.Y
圖片/網絡+原創

核酸純化在分子生物學實驗室已經廣泛應用。怎樣獲得高質量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實驗的順利進行至關重要，因此，對純化后的核酸進行鑒定也是必不可少的步驟。本文簡單的回顧學習一下核酸鑒定的方法。

核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定

1.濃度/純度鑒定

（1）紫外分光光度計：
原理：由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質。核酸在紫外光譜區有一條典型的吸收曲線，其吸收高峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質在紫外區的吸收高峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數據是鑒定核酸的重要依據之一。

由于核苷酸最大吸收波長為260nm,根據朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于50µg/ml的雙鏈DNA， 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。

計算公式:
dsDNA（µg/µl）=OD260x50x稀釋倍數/1000
RNA（µg/µl）=OD260x40x稀釋倍數/1000

純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會偏低，因為PH值和離子存在會影響光的吸收值。

當OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質含量較高，可用利用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較高。可用RNaseA消化后再進行純化。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機試劑污染。

實例：基因組DNA提取得率和純度

FOREGENE Soil DNA Isolation Kit( DE-05511)

特點：

簡便—無需研磨、無需低溫操作。

快速—90min內完成操作。

安全—無需有機試劑。

本試劑盒處理各種來源土壤樣本，獲得的基因組DNA量和純度見下表：

純凈的RNA OD260/OD280=2.0，制備的樣品DNA比值在1.8-2.1 ，OD260/OD280比值會受到所用溶液PH值的影響，例如，純化的RNA在PH=7.5的緩沖液中OD260/OD280讀數在1.9-2.1之間，而在中性的水溶液中比值會偏低，可能只有1.8-2.0，這并不意味著RNA的質量變差，所以還需要做電泳檢測。

OD260/OD280<1.8時，溶液中可能存在蛋白或者其他有機物的污染。
OD260/OD230的值，一般不小于2.0，若小于2.0，表明有胍鹽，β-巰基乙醇或乙醇的殘留,但是根據樣品不同，比值可能有所變化，如下表中小鼠腎和腦組織提取出的RNA260/230比值偏小。

實例：組織RNA提取得率和純度

FOREGENE Animal Total RNA Isolation Kit （RE-03012）

特點：

簡便—無需低溫操作。

快速—30min內完成操作。

安全—無需有機試劑。

本試劑盒處理各種小鼠組織樣本，獲得的RNA量和純度見下表：

（2）熒光光度法：
熒光光度法以核酸染料溴化乙錠EB嵌入堿基平面后，使本身無熒光的核酸在紫外線激發下發出橙色熒光，且熒光強度積分與核酸含量成正比。該方法靈敏度可達到1-5ng，適合低濃度核酸溶液的定量分析。另外，SYBR Gold作為一種新的超靈敏的熒光燃料，可以從瓊脂糖凝膠中檢測出低于20pg的雙鏈DNA。

用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA大許多，電泳遷移率低；RNA中rRNA最多，占80-85%,tRNA及核內小分子RNA占15%-20%，mRNA占1%-5%。RNA電泳后可呈現特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA與tRNA組成的條帶。真核生物為28S 、18S 的rRNA及由5S、 5.8S的rRNA和tRNA組成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一，一般是看不到的。通過電泳分析我們可以鑒定在RNA制品中有無DNA污染，亦可鑒定在DNA制品中有無RNA污染。