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最新生物標志物biomarker檢測技術進展(四)

瀏覽次數:5685 發布日期:2016-7-26  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

全新的SMC單分子檢測技術

雖然現有多項生物標志物檢測技術已經豐富了人們對生物標志物的認識,獲取了大量數據和經驗,解決了很多生物學或醫學問題,但如前文所述的諸多瓶頸仍限制了生物標志物的應用。尤其是對于疾病,特別是腫瘤的早期診斷或預防而言,在疾病的潛伏期或是發生早期,就能在血清/血漿這樣容易獲得且遠離病灶的樣本中發現生物標志物的存在十分必要。研究表明這些標志物的含量很可能低至每毫升亞皮克級。上述幾乎所有的技術對于這一檢測區間都顯得無能為力。第二,據文獻報道,在已知的約400,000種人類蛋白中,有大約75%,也就是300,000種被現有技術很難檢測到。大量生物標志物處在現有技術的檢測極限之下。第三,現有技術很多情況下受制于較低的靈敏度,僅能在疾病個體中測得某種生物標志物,而此時疾病可能已經進入實際發生階段。在健康個體或是疾病風險的個體中盡管這些標志物含量極低,但很可能具備預測性作用,而現有技術無法有效利用這一點。第四,醫學研究者在臨床上獲取了各種類型的體液樣本,例如腦脊液、宮頸液、肺泡灌洗液、淚液、尿液等,這些體液樣本中經常生物標志物含量極低,但卻具備特定領域的獨特研究價值,而其中蘊含的寶貴生物學信息常被現有技術忽略。因此,人們亟需開發更為靈敏且特異的生物標志物檢測技術來更好地滿足基礎醫學或轉化醫學的研究需要。

圖5. 單分子檢測技術原理

新技術的誕生為這些研究需求的實現提供了重要的機會。單分子檢測技術(Single Molecule Counting, SMC),在抗體依賴的蛋白生物標志物檢測方面產生了質的變化。單分子檢測主流的檢測技術以Erenna等單分子檢測平臺為代表(也被稱為Singulex),基本原理在于利用毛細管進行熒光素標記分子的上樣,并以激光聚焦的方式進行單個分子的激發檢測。當熒光素標記分子通過高能量的激光焦點時,單個蛋白分子偶聯的熒光素所發射的光閃爍信號被檢測器測得。光閃爍信號的次數和強度與分子濃度呈正相關性,從而能建立標準曲線。通過對一定時間之內光閃爍信號進行統計,可以對溶液濃度進行定量檢測(圖5)。這項技術的創始存在一定爭議,有多位學者在同一時期利用單分子檢測技術對不同分子進行了單分子檢測,并取得了成功。其中代表性的工作包括:1996年,Chen等學者成功進行了藻紅蛋白的單分子檢測;同一年,Craig等學者利用單分子檢測技術檢測了堿性磷酸酶;1998年,Fister等學者進行了羅丹明6G分子的單分子檢測。[3-5]

針對蛋白生物標志物的檢測,單分子免疫檢測試劑盒仍采用比較典型的雙抗免疫夾心法。與普通ELISA均勻照射96孔板板底的檢測方式不同,SMC技術試劑盒會將形成雙抗免疫夾心復合物的分子進行解離,然后利用單分子檢測方法對熒光素標記的二抗進行測定(圖6)。這項技術最大的優勢在于靈敏度顯著提高,在實際工作中經常能達到每毫升百分之幾皮克的靈敏度(圖7),大致相當于普通ELISA 1000倍左右的水平。

圖6. 單分子免疫檢測的實驗流程

圖7. 抗體依賴的生物標志物檢測技術靈敏度對比(引自參考文獻)

相對于前面所綜述的傳統檢測技術,SMC單分子檢測技術的應用正處于高速發展階段。盡管行業內普遍看好,但這項技術為生物標志物檢測帶來的變革仍需時間來證明。該技術在肌鈣蛋白(Troponin I, cTnI)檢測案例中已經展現出非常重要的價值。與傳統技術僅能檢測心臟疾病個體的cTnI因子不同,這項技術在健康個體中就可測得痕量的cTnI因子。長達12年的研究結果展示了令人驚訝的發現(圖8[6]),健康個體的本底cTnI因子與未來心臟病的累積發病率呈反比。在另一項高水平的研究報告中,亨廷頓舞蹈病的未發病個體(突變基因攜帶者)腦脊液中微量的突變型mHTT蛋白可被穩定測得,為亨廷頓舞蹈病的診斷和治療提供了全新的方案[8]

圖8. 單分子檢測技術對健康個體cTnI的檢測可預測心臟病累積發病率

 

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發布者:默克生命科學
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