移植NEP基因轉染的神經干細胞對AD大鼠行為學的影響

阿爾茨海默病(Alzheimer disease ，AD)病理過程的關鍵問題是患者腦中p一淀粉樣多肽的異常增加和沉積。中性內膚酶( NEP)是腦內最重要的A p降解酶，是影響腦內Ap分解代謝速率的限制因素。神經干細胞(neural stem cell ， NSC)是具有向多種細胞系分化又具有自我更新能力的細胞。NSC、治療AD是運用其特性修復和替代受損的神經細胞，另外，NSCs是非常理想的基因載體，擁有許多其他載體所沒有的優點。本實驗將NEP基因轉染的神經干細胞移植到AD大鼠側腦室，觀察行為學的變化，為阿爾茨海默病的治療提供新的依據。

1材料和方法

1. 1實驗動物

    清潔SD大鼠由佳木斯大學動物實驗中心提供。

1.2主要試劑

胎牛血清、Ap1一40、神經干細胞基礎培養基、神經干細胞完全培養基、神經小球分散試劑盒等均購于美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立

選左側海馬CAI區為注射區:根據Pellegrino和Cusmhna的大鼠腦立體定位圖譜，確定本研究中的注射坐標為前囪后3. 3mm，中線左側2. 2mm，硬腦膜下2. 8mm。用微量加樣器緩慢注射Ap一40溶液1 uL，之后緩慢撤針，充分消毒，縫合皮膚。術后常規飼養，待兩周后做細胞移植。

3. 2分組和細胞移植

30只AD大鼠在隨機分為3組，每組各10只:AD模型組、移植神經干細胞組(NSCs組)和移植NEP基因轉染神經干細胞組(NEP一NSCs組)。選左側海馬C AI區在3組AD大鼠分別微量植入6},L細胞培養液、NSC懸液及NEP一NSC懸液(濃度約為1 x 105個細胞樞L)，注射完畢后，全層縫合頭皮，腹腔注射青霉素，術后放置于溫暖安靜處至清醒。每組大鼠術后第8周進行實驗。

1.3.3隱蔽平臺實驗

實驗期限為6d。實驗前讓大鼠自由游泳1分。在水迷宮象限的中央固定隱蔽平臺的位置，將每只大鼠頭朝外壁在任何一個象限內的隨機位置放入水中，大鼠爬到平臺上或到達60秒時，實驗立即停止。大鼠自己爬到平臺或操作人員引導使其爬上平臺后停留10秒。每天訓練4次，每次間隔30min。通過影像系統記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。此實驗用于測量動物在水迷宮中的學習和記憶能力。

1.3.4空間探索實驗

第7天在水迷宮中撤除平臺，將動物在任意一個入水點將放入水中，檢測60秒時間內，大鼠出現在目標象限(target quadrant } TQ)的百分比。此實驗用來檢測動物保持記憶能力。

1.4統計學方法

采用SPSS 11. 3軟件分析，各組間統計分析應用t檢驗。實驗數據以表示。

2結果

2. 1行為學測試

與AD模型組相比，NEP一NSCs組和NSCs組的AD大鼠在第4,5,6天的平均潛伏期均明顯縮短(P < 0. OS)，以NEP一NSCs組尤為明顯，且NEP -NSCs組的AD大鼠在第4,5,6天的平均潛伏期亦明顯比NSCs組縮短(P<0. 05)

2. 2空間探索實驗

與AD模型組相比，NSCs組和NEP一NSCs組AD大鼠在目標象限探索時間的百分比有所增加，以NEP一NSCs組明顯，但無統計學差異(P>0. 05 )。

3討論

    本實驗中Ap海馬C AI區微量注射制備AD大鼠模型，將NEP基因轉染的神經干細胞移植到AD模型大鼠側腦室區，通過隱蔽平臺獲得實驗和空間搜索實驗評價NEP基因轉染對AD大鼠學習記憶的影響。實驗結果顯示:隱蔽平臺獲得實驗中，與AD模型組相比，NEP一NSCs組和NSCs組在第4,5,6天的平均潛伏期均明顯縮短(P < 0. OS);與NSCs組相比，NEP一NSCs組第4,5,6天的平均潛伏期亦明顯縮短(P<0. OS )。這表明NEP一NSCs  組和NSCs組均能顯著改善AD大鼠的學習和記憶功能。空間探索實驗中，與AD模型組相比，NEP -NSCs組和NSCs組在TQ象限搜索時間的百分比有所增加，但無統計學意義。水迷宮實驗表明，海馬移植了轉染NEP基因的神經干細胞后，可以明顯改善AD大鼠的學習和記憶功能，原因是由于海馬移植了轉染NEP基因的的神經干細胞后，可以高表達NEP蛋白，NEP蛋白是Ap降解酶，因此可以減少Ap在皮層及海馬區的沉積，降低了Ap對神經系統的毒性作用。從而改善和提高了AD大鼠的學習和記憶功能。