利用安捷倫SampliQ SCX 固相萃取柱和液相色譜/串聯質譜聯用檢測豬肉中的β2-激動劑

應用報告/食品安全

作者: Chenhao Zhai 安捷倫科技有限公司
中國上海外高橋保稅區，英倫路412 號 上海，200131 中國

Jianzhong Li and Yue Song 安捷倫科技有限公司
福州路318 號, 高騰大廈11 樓 上海200001 中國

摘要
本應用報告開發并驗證了一種同時檢測四種β2-激動劑殘留物的方法，包括特布他林、 沙丁胺醇、克侖特羅和福莫特羅。分析物經過液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)純化后， 由正離子多反應監測模式下的液相色譜耦合電噴霧串聯質譜(LC-ESI-MS/MS)進行定量。

該方法為檢測豬肉中四種β2-激動劑提供了亞ng/g 水平的檢測限（LOD），以及0.25 至5 ng/g 的動態校準范圍。總回收率為78%至101%, 相對標準偏差(RSD)為1.8%至7.2%。

前言
β2-激動劑是廣泛應用于豬肉生產中的一種非法生長促進劑。最近發生的中毒事件都是因為豬肉中含有高水平的β-激動劑（克侖特羅）。本應用報告采用了安捷倫公司新推出的固相萃取（SPE）產品來提取和濃縮豬肉中的β-激動劑，并采用LC-MS/MS 進行分析。表1 給出了四種β-激動劑化合物的名稱和結構。

表1. 本研究中采用的β2-激動劑化合物

實驗
試劑及藥品
所有試劑都是質譜純級、高效液相純級或分析純級。

乙腈和水由Scharlau 公司提供。乙酸乙酯、異丙醇由Fisher 公司提供。標準物均采購自國家藥品生物制品檢定所（NICPBP）。 豬肉則由本地市場采購。 以甲醇配制單個標準溶液（1.0 mg/mL），并在4 °C 下冷藏。

以甲醇-水(10:90) 配制合并工作溶液（10 μg/mL），并在4 °C 下冷藏。添加溶液應每周配制, 以適當稀釋合并工作溶液來制備。

設備與材料
安捷倫1200 高效液相色譜系統
安捷倫6460 三重四極桿液相色譜-質譜/質譜聯用系統
安捷倫SamliQ SCX 聚合物柱，50×3 mL 管，60 mg（部件號：5982-3236）
安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱，50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件號: 959741-906)
安捷倫真空歧管處理盒(部件號: 5982-9120)

樣品制備
液-液提取
于15mL 帶蓋聚丙烯管中稱取2 g 豬肉（精確至±0.01 g）。加入 8 mL 0.2M 的乙酸鈉（pH 值5.2）溶液，并渦旋以混合均勻。然后加入100 μL β-葡萄糖醛酸酶（1000 U/mL）并渦旋混合2 分鐘。樣品在37 °C 下水解16 小時。

水解產物經震動處理15 分鐘后，在離心機中用4000rpm 的速度離心分離10 分鐘。取4 mL 上層清液至另一離心管中，加入5 mL
0.1M 高氯酸溶液并調節pH 值至1 ± 0.3，再在離心機中以 4000 rpm 的速度離心分離10 分鐘。將上層清液移至另一試管中，用10M 氫氧化鈉溶液調節其pH 值至11。

于樣品試管中分別添加10 mL 飽和氯化鈉溶液和異丙醇-乙酸乙酯（60:40）混合液，并震動處理5 分鐘。以4000 rpm 離心分離5 分鐘后, 將有機層仔細轉移至另一離心管中。將異丙醇-乙酸乙酯混合液的添加、震動處理、離心分離和轉移有機液層的過程重復兩次，并將所有上清液合并。

樣品于40 °C 以氮氣吹干，并將殘留物復溶于5 mL 0.2M 的乙酸鈉（pH 值5.2）溶液中。該樣品將用于固相萃取純化。

固相萃取
固相萃取過程（SPE）如圖1 中所示。先用3 mL 甲醇活化安捷倫SampliQ SCX 柱，然后用3 mL 水平衡。取5 毫升樣品溶液載入到柱中，并以重力通過色譜柱（約1 mL/min）。用2 mL 水和2 mL

2%甲酸水溶液沖洗SPE 小柱，丟棄所有洗脫液。真空抽干SPE 小柱。最后以5 mL 5%氨甲醇溶液洗脫，流速約為1 mL/min。洗脫液于40 °C 氮氣吹干，殘留物復溶于1 mL 0.1%甲酸的水/乙腈 （90:10）溶液。樣品經渦旋混合和超聲波處理以完全溶解后轉移 至1.5 mL 離心管中，并在3000 rpm 條件下處理5 分鐘。最后將樣品轉移至2 mL 的色譜小瓶中等待分析。

圖1. 豬肉的清理和濃縮-固相萃取過程

儀器條件
高效液相色譜條件
色譜柱: 安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18 色譜柱，
50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件號: 959741-906)
流速: 0.4 mL/min
柱溫: 40 °C
進樣體積: 5 μL
流動相: 水（0.1%甲酸溶液+2mM乙酸銨，A），
乙腈（0.1%甲酸, B）

梯度淋洗:

質譜條件
在正極模式下對4 種化合物進行了監測。離子源條件如圖2 所示，多反應監測通道如表2 中所示。

圖2. 四種化合物的質譜源參數

表2. 多反應監測模式的質量監測

結果與討論
線性與檢測限
標準工作曲線（0.25，0.5，1.0，2.0 和5.0 ng/g）是以添加適量混合工作溶液于空白基質來配制的。空白基體是通過將豬肉進行水解、液液萃取和固相萃取來制備的。校準曲線的結果如表3 中所示。檢測限(LOD)定義為每個化合物給出信噪比(S/N)大于3:1 的時濃度。各化合物的檢測限也列于表3 中。

表3. β2-激動劑的線性和檢測限

回收率和重現性
在豬肉中分別添加標樣濃度為0.5, 1.0, 2.0 ng/g, 計算回收率和重現性。每個濃度重復分析6 次。回收率和重現性數據列于表4 中。 添加豬肉萃取物（1.0 ng/g）的色譜圖如圖3 中所示。

表4. 采用安捷倫SampliQ SCX 進行固相萃取豬肉中β2-激動劑的回收率和重現性；(部件號: 5982-3236)， 平均回收率90%，平均相對標準偏差4.4%

圖3. 1.0 ng/g 添加豬肉樣品萃取物的色譜圖

結論
本研究表明，安捷倫SampliQ SCX 可以作為在復雜基體中（如豬肉）進行多種β2-激動劑的純化和濃縮的有效方法。用標準添加基質所測定的回收率和重現性, 符合豬肉中β2-激動劑殘留物檢測的中國國家標準。雜質以及基質效應是不會干擾任何目標化合物的定量，最低定量限明顯低于最高殘留限量[1,2]。

參考文獻
1. GB/T 21313-2007“動物源性食品中β2-激動劑的高效液相色譜串聯質譜法分析”
2. SN/T 1924-2007“進出口動物源性食品中的克侖特羅、雷托巴胺、沙丁胺醇和特布他林殘留物的高效液相色譜-質譜/質譜聯用法測定”

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