核酸原位雜交在哺乳動物基因定位中的進展

瀏覽次數：101　發布日期：2025-4-30　來源：威尼德生物科技

摘要

基于優化后的核酸原位雜交技術，建立了高效、靈敏的哺乳動物基因定位體系。通過改進探針設計、優化雜交條件及采用威尼德原位雜交儀，顯著提升了檢測分辨率與特異性。實驗證明，該方法可在單細胞水平實現靶基因的精確定位，同時降低試劑消耗與時間成本，為基因功能研究與臨床診斷提供可靠工具。

引言

核酸原位雜交（ISH）作為基因定位的核心技術，通過特異性探針與靶核酸序列的互補結合，實現基因在細胞或組織中的空間可視化。哺乳動物基因組的高度復雜性對傳統ISH技術提出了挑戰，包括背景噪聲高、靈敏度不足及操作流程繁瑣等問題。近年來，隨著探針標記技術、信號放大系統及自動化儀器的迭代，ISH在分辨率與穩定性上取得顯著突破。

研究針對哺乳動物基因定位需求，通過整合高親和力探針、優化雜交動力學參數及采用威尼德原位雜交儀，構建了一套高靈敏度、低成本的ISH實驗體系。重點解決了傳統技術中探針穿透性差、非特異性結合及耗時長的痛點，為基因表達調控、染色體異常檢測等研究提供技術支持。

實驗部分

1. 樣本制備與預處理

組織切片處理

取成年小鼠腦組織，經4%多聚甲醛固定24小時后，梯度蔗糖脫水并包埋于OCT化合物。使用威尼德冷凍切片機制備10 μm厚切片，貼附于經多聚賴氨酸處理的載玻片。切片依次經蛋白酶K（某試劑，0.1 mg/mL，37℃消化15分鐘）、0.1 M甘氨酸終止反應，并進行乙酰化處理（乙酸酐/三乙醇胺溶液，10分鐘）以減少靜電吸附。

細胞樣本制備

培養的HeLa細胞經0.1% Triton X-100透膜處理5分鐘，PBS洗滌后固定于4%多聚甲醛（某試劑）中20分鐘。使用威尼德紫外交聯儀（254 nm，300 mJ/cm²）進行交聯，增強核酸與載體的結合強度。

2. 探針設計與標記

針對小鼠神經元特異性基因 NeuN 設計雙標記探針（5'端Cy3熒光標記，3'端地高辛標記）。探針長度控制在500-800 bp，GC含量45-55%，通過BLAST驗證特異性。使用威尼德分子雜交儀進行探針變性（95℃ 5分鐘，冰浴驟冷），并與預雜交緩沖液（某試劑，含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖）混合。

3. 雜交與信號放大

將變性探針（20 ng/μL）滴加至樣本，覆蓋硅化蓋玻片，置于威尼德原位雜交儀中（42℃濕盒內孵育16小時）。洗脫步驟采用2× SSC（含50%甲酰胺）梯度清洗，去除非特異性結合。信號放大依次進行：

抗地高辛抗體（某試劑，1:500）37℃孵育1小時；

生物素化二抗（某試劑，1:1000）結合；

ABC復合物（某試劑）催化DAB顯色，熒光信號經威尼德共聚焦顯微鏡采集。

4. 數據分析

使用ImageJ軟件定量熒光強度，閾值設定為背景信號的3倍標準差。空間定位數據通過ZEN軟件三維重建，分辨率提升至0.2 μm。

關鍵技術創新與優勢

1. 成本優化策略

通過威尼德原位雜交儀的溫控模塊（精度±0.1℃）減少探針損耗，單次實驗試劑成本降低40%；

封閉緩沖液改用自制魚精DNA/BSA混合液（某試劑替代商業產品），年節省預算超10萬元。

2. 靈敏度提升