ChIP-seq等技術在揭示桃樹需冷量和芽休眠調控的關鍵基因中的應用
桃樹（Prunus persica）等多年生果樹的芽休眠是其冬季生存的關鍵策略，需冷量（chilling requirement，CR）是打破休眠的必要條件之一。然而，全球變暖導致許多地區的需冷量難以滿足，影響了桃樹的生長和發育。因此，理解需冷量和芽休眠（bud dormancy）的遺傳機制對于培育適應不同地理區域的低需冷量品種具有重要意義。
近日，中國農科院鄭州果樹所桃資源與育種團隊趙亞林博士、李勇副研究員為共同第一作者，王力榮研究員為通訊作者，在《Plant Physiology》雜志發表題為“MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach”科研成果，研究通過基因組關聯研究（GWAS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等多種方法，系統分析了桃樹需冷量和芽休眠調控機制，并系統揭示了MADS-box蛋白PpDAM6基因的功能和調控網絡。
標題：MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach（MADS-box蛋白PpDAM6調控桃樹需冷量介導的休眠和芽萌發）
發表期刊：Plant Physiology（植物生理學）
影響因子： IF 6.5 / 1區
技術平臺：ChIP-seq等
本研究通過基于345份桃樹（Prunus persica (L.) Batsch）材料的結構變異的全基因組關聯研究（GWAS），鑒定出PpDAM6（DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box）是調控需冷量的關鍵基因。通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，以及在轉基因蘋果（Malus×domestica）中穩定過表達該基因，驗證了PpDAM6在需冷量調控中的功能。結果表明，PpDAM6在調控桃樹和蘋果的芽破眠、隨后的營養生長和開花過程中具有進化上保守的功能。PpDAM6啟動子區域的30-bp缺失與低需冷量品種中PpDAM6表達量的降低顯著相關。基于這一30-bp插入/缺失（indel）開發的PCR標記可用于區分非低需冷量和低需冷量的桃樹品種。ChIP-seq結果表明，在低需冷量和非低需冷量品種中，PpDAM6位點的H3K27me3修飾在休眠過程中未表現出明顯變化，且從全基因組水平來看，低需冷量品種的H3K27me3修飾發生得更早。PpDAM6能夠通過誘導下游基因PpNCED1（9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶1，ABA生物合成的關鍵酶）和CALS（胼胝質合成酶）的表達來介導細胞間通訊。本研究揭示了由PpDAM6復合體形成的基因調控網絡，該網絡介導了桃樹需冷量調控下的休眠和芽破眠過程。對需冷量自然變異遺傳基礎的深入理解，將有助于育種者開發適合在不同地理區域種植的不同需冷量品種。
圖形摘要：桃樹芽破眠相關遺傳組分的模型
研究方法
（1）基因組關聯研究（GWAS）
樣本選擇：選取345份桃樹材料，包括野生種、地方品種和改良品種。
測序和變異檢測：對這些材料進行全基因組重測序，識別結構變異（SVs）。
關聯分析：利用GWAS分析，將SVs與需冷量表型進行關聯，識別顯著的基因位點。
（2）候選基因鑒定
連鎖不平衡（LD）分析：通過LD分析縮小關聯信號區域，確定候選基因。
啟動子變異分析：識別PpDAM6啟動子區域的30-bp缺失，并通過Sanger測序驗證其與需冷量的關聯。
（3）功能驗證
病毒誘導基因沉默（VIGS）技術：在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，觀察芽休眠和萌發的變化。
轉基因蘋果：在蘋果中過表達PpDAM6，觀察需冷量和芽萌發的變化。
擬南芥轉基因：在擬南芥中過表達PpDAM6，觀察開花時間和花器官發育的變化。
（4）表達分析
RT-qPCR：分析PpDAM6在不同需冷量品種中的表達水平。
啟動子活性分析：構建GUS報告基因載體，通過GUS染色和雙熒光素酶報告系統驗證啟動子活性。
（5）分子機制探索
ChIP-seq技術：分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾（如H3K27me3）變化。
酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）：鑒定與PpDAM6相互作用的蛋白。
激素信號通路分析：研究PpDAM6與ABA和GA信號通路的關系。
結果圖形
（1）GWAS鑒定需冷量（CR）候選基因
研究者通過對345份桃樹材料的全基因組重測序數據進行分析，基于結構變異（SVs）識別與需冷量相關的基因位點。發現了一個顯著的信號，位于染色體1上的PpDAM6基因附近，特別是其啟動子區域的一個30-bp缺失（indel）與低需冷量表型顯著相關。
圖1：桃樹需冷量調控關鍵候選基因的GWAS分析和表達分析。
（2）PpDAM6基因的功能驗證
通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，發現芽破眠和萌發時間提前。在轉基因蘋果中過表達PpDAM6，發現轉基因植株的需冷量增加，芽萌發時間延遲。
據報道，低溫條件下梨（pear）中DAM類基因的啟動子區域會出現類似H3K27me3的抑制性標記增加。但本研究并未觀察到在4°C低溫處理后，低需冷量（CR）或非低需冷量品種的PpDAM6位點上H3K27me3標記的顯著增加（圖3A）。這表明，與其他DAM類基因不同，PpDAM6抑制并非由于PpDAM6位點上H3K27me3增加所致。此外，在全基因組水平上，低需冷量品種的H3K27me3修飾發生得更早；然而，當需冷量滿足時，非低需冷量品種的三甲基化強度更高（圖3A和B）。這些結果表明，PpDAM6啟動子中的30-bp插入/缺失（indel）與PpDAM6的表達水平直接相關，進而與需冷量相關聯。
B. Metagene圖顯示桃樹參考基因組中轉錄基因區域兩端各延伸2kb的H3K27me3峰值分布。TSS表示轉錄起始位點；TES表示轉錄終止位點。
（3）PpDAM6通過反饋回路（feedback loop）方式參與ABA信號通路
PpDAM6可能通過ABA信號通路調控休眠。ABA含量在休眠期間逐漸下降，與PpDAM6表達模式相似。PpDAM6能夠正向調控ABA生物合成基因PpNCED1的表達，形成反饋回路。
（4）PpDAM6在休眠過程中協調細胞間通訊
PpDAM6通過調控PpCALS1/2基因的表達影響細胞間的胼胝質沉積（callose formation），進而調控細胞間通訊。胼胝質沉積在低溫積累過程中逐漸減少，與PpDAM6表達下調一致。
易小結
該研究通過GWAS和ChIP-seq等分析揭示了PpDAM6在桃樹需冷量和芽休眠調控中的關鍵作用，為理解多年生植物休眠的分子機制提供了新的視角。研究還通過開發基于30-bp indel的PCR標記，快速篩選出低需冷量的桃樹品種，為培育適應不同氣候條件的桃樹品種提供了有力工具。
本研究表明PpDAM6與ABA信號通路密切相關，進一步完善植物激素在休眠調控中的作用網絡。PpDAM6通過調控胼胝質沉積影響細胞間通訊，為理解芽破眠的細胞學基礎提供新線索。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究ChIP-seq技術用于分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾狀態，特別是H3K27me3修飾。幫助研究者了解PpDAM6在不同需冷量品種中的表觀遺傳調控機制。通過ChIP-seq分析，研究者發現PpDAM6基因位點的H3K27me3修飾在不同需冷量品種中沒有顯著差異。這表明PpDAM6的表達調控可能不依賴于H3K27me3修飾，而是與啟動子區域的30-bp缺失直接相關。
ChIP-seq技術還用于分析其他與需冷量相關的基因（如PpNCED1和PpCALS1/2）的組蛋白修飾狀態，這些基因的表達與PpDAM6密切相關，ChIP-seq幫助構建完整的基因調控網絡。
參考文獻：
Zhao YL, Li Y, Cao K, Yao JL, Bie HL, Khan IA, Fang WC, Chen CW, Wang XW, Wu JL, Guo WW, Wang LR. MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach. Plant Physiol. 2023 Aug 31;193(1):448-465. pii: 7175985. doi: 10.1093/plphys/kiad291.
近日，中國農科院鄭州果樹所桃資源與育種團隊趙亞林博士、李勇副研究員為共同第一作者，王力榮研究員為通訊作者，在《Plant Physiology》雜志發表題為“MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach”科研成果，研究通過基因組關聯研究（GWAS）、染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等多種方法，系統分析了桃樹需冷量和芽休眠調控機制，并系統揭示了MADS-box蛋白PpDAM6基因的功能和調控網絡。
標題：MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach（MADS-box蛋白PpDAM6調控桃樹需冷量介導的休眠和芽萌發）
發表期刊：Plant Physiology（植物生理學）
影響因子： IF 6.5 / 1區
技術平臺：ChIP-seq等
本研究通過基于345份桃樹（Prunus persica (L.) Batsch）材料的結構變異的全基因組關聯研究（GWAS），鑒定出PpDAM6（DORMANCY-ASSOCIATED MADS-box）是調控需冷量的關鍵基因。通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，以及在轉基因蘋果（Malus×domestica）中穩定過表達該基因，驗證了PpDAM6在需冷量調控中的功能。結果表明，PpDAM6在調控桃樹和蘋果的芽破眠、隨后的營養生長和開花過程中具有進化上保守的功能。PpDAM6啟動子區域的30-bp缺失與低需冷量品種中PpDAM6表達量的降低顯著相關。基于這一30-bp插入/缺失（indel）開發的PCR標記可用于區分非低需冷量和低需冷量的桃樹品種。ChIP-seq結果表明，在低需冷量和非低需冷量品種中，PpDAM6位點的H3K27me3修飾在休眠過程中未表現出明顯變化，且從全基因組水平來看，低需冷量品種的H3K27me3修飾發生得更早。PpDAM6能夠通過誘導下游基因PpNCED1（9-順式環氧類胡蘿卜素雙加氧酶1，ABA生物合成的關鍵酶）和CALS（胼胝質合成酶）的表達來介導細胞間通訊。本研究揭示了由PpDAM6復合體形成的基因調控網絡，該網絡介導了桃樹需冷量調控下的休眠和芽破眠過程。對需冷量自然變異遺傳基礎的深入理解，將有助于育種者開發適合在不同地理區域種植的不同需冷量品種。
圖形摘要：桃樹芽破眠相關遺傳組分的模型
研究方法
（1）基因組關聯研究（GWAS）
樣本選擇：選取345份桃樹材料，包括野生種、地方品種和改良品種。
測序和變異檢測：對這些材料進行全基因組重測序，識別結構變異（SVs）。
關聯分析：利用GWAS分析，將SVs與需冷量表型進行關聯，識別顯著的基因位點。
（2）候選基因鑒定
連鎖不平衡（LD）分析：通過LD分析縮小關聯信號區域，確定候選基因。
啟動子變異分析：識別PpDAM6啟動子區域的30-bp缺失，并通過Sanger測序驗證其與需冷量的關聯。
（3）功能驗證
病毒誘導基因沉默（VIGS）技術：在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，觀察芽休眠和萌發的變化。
轉基因蘋果：在蘋果中過表達PpDAM6，觀察需冷量和芽萌發的變化。
擬南芥轉基因：在擬南芥中過表達PpDAM6，觀察開花時間和花器官發育的變化。
（4）表達分析
RT-qPCR：分析PpDAM6在不同需冷量品種中的表達水平。
啟動子活性分析：構建GUS報告基因載體，通過GUS染色和雙熒光素酶報告系統驗證啟動子活性。
（5）分子機制探索
ChIP-seq技術：分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾（如H3K27me3）變化。
酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）：鑒定與PpDAM6相互作用的蛋白。
激素信號通路分析：研究PpDAM6與ABA和GA信號通路的關系。
結果圖形
（1）GWAS鑒定需冷量（CR）候選基因
研究者通過對345份桃樹材料的全基因組重測序數據進行分析，基于結構變異（SVs）識別與需冷量相關的基因位點。發現了一個顯著的信號，位于染色體1上的PpDAM6基因附近，特別是其啟動子區域的一個30-bp缺失（indel）與低需冷量表型顯著相關。
圖1：桃樹需冷量調控關鍵候選基因的GWAS分析和表達分析。
（2）PpDAM6基因的功能驗證
通過在桃樹芽中瞬時沉默PpDAM6基因，發現芽破眠和萌發時間提前。在轉基因蘋果中過表達PpDAM6，發現轉基因植株的需冷量增加，芽萌發時間延遲。
圖2：30bp缺失對PpDAM6啟動子活性的影響
據報道，低溫條件下梨（pear）中DAM類基因的啟動子區域會出現類似H3K27me3的抑制性標記增加。但本研究并未觀察到在4°C低溫處理后，低需冷量（CR）或非低需冷量品種的PpDAM6位點上H3K27me3標記的顯著增加（圖3A）。這表明，與其他DAM類基因不同，PpDAM6抑制并非由于PpDAM6位點上H3K27me3增加所致。此外，在全基因組水平上，低需冷量品種的H3K27me3修飾發生得更早；然而，當需冷量滿足時，非低需冷量品種的三甲基化強度更高（圖3A和B）。這些結果表明，PpDAM6啟動子中的30-bp插入/缺失（indel）與PpDAM6的表達水平直接相關，進而與需冷量相關聯。
圖3：桃樹中H3K27me3的ChIP-Seq分析及EVG位點中H3K27me3水平。
A. 可視化桃樹基因組中的H3K27me3 peaks值IGV圖。藍色峰值代表低需冷量品種（LCR）中的H3K27me3，綠色峰值代表高需冷量品種（HCR）中的H3K27me3分布。紅色方框表示一個基因的不同轉錄本，DAM基因上的峰值用紫色方框標記。PpDAM2位于PpDAM1覆蓋的區域內，特別用黑色方框圈出。LCR-1和HCR-1代表休眠開始階段；LCR-3和HCR-3代表芽破眠階段。B. Metagene圖顯示桃樹參考基因組中轉錄基因區域兩端各延伸2kb的H3K27me3峰值分布。TSS表示轉錄起始位點；TES表示轉錄終止位點。
圖4：在轉基因蘋果和桃花芽瞬時轉化中驗證了 PpDAM6 的芽萌發和需冷量介導的休眠調控。
（3）PpDAM6通過反饋回路（feedback loop）方式參與ABA信號通路
PpDAM6可能通過ABA信號通路調控休眠。ABA含量在休眠期間逐漸下降，與PpDAM6表達模式相似。PpDAM6能夠正向調控ABA生物合成基因PpNCED1的表達，形成反饋回路。
圖5：PpDAM6參與ABA信號通路。
（4）PpDAM6在休眠過程中協調細胞間通訊
PpDAM6通過調控PpCALS1/2基因的表達影響細胞間的胼胝質沉積（callose formation），進而調控細胞間通訊。胼胝質沉積在低溫積累過程中逐漸減少，與PpDAM6表達下調一致。
圖6：PpDAM6介導細胞間通訊。
圖7：CALS1/2和NCED1在休眠桃花芽中的功能驗證。
易小結
該研究通過GWAS和ChIP-seq等分析揭示了PpDAM6在桃樹需冷量和芽休眠調控中的關鍵作用，為理解多年生植物休眠的分子機制提供了新的視角。研究還通過開發基于30-bp indel的PCR標記，快速篩選出低需冷量的桃樹品種，為培育適應不同氣候條件的桃樹品種提供了有力工具。
本研究表明PpDAM6與ABA信號通路密切相關，進一步完善植物激素在休眠調控中的作用網絡。PpDAM6通過調控胼胝質沉積影響細胞間通訊，為理解芽破眠的細胞學基礎提供新線索。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究ChIP-seq技術用于分析PpDAM6基因位點的組蛋白修飾狀態，特別是H3K27me3修飾。幫助研究者了解PpDAM6在不同需冷量品種中的表觀遺傳調控機制。通過ChIP-seq分析，研究者發現PpDAM6基因位點的H3K27me3修飾在不同需冷量品種中沒有顯著差異。這表明PpDAM6的表達調控可能不依賴于H3K27me3修飾，而是與啟動子區域的30-bp缺失直接相關。
ChIP-seq技術還用于分析其他與需冷量相關的基因（如PpNCED1和PpCALS1/2）的組蛋白修飾狀態，這些基因的表達與PpDAM6密切相關，ChIP-seq幫助構建完整的基因調控網絡。
參考文獻：
Zhao YL, Li Y, Cao K, Yao JL, Bie HL, Khan IA, Fang WC, Chen CW, Wang XW, Wu JL, Guo WW, Wang LR. MADS-box protein PpDAM6 regulates chilling requirement-mediated dormancy and bud break in peach. Plant Physiol. 2023 Aug 31;193(1):448-465. pii: 7175985. doi: 10.1093/plphys/kiad291.
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