摘要
威尼德電穿孔儀將人胰島素原基因（hINS）高效導入綿羊成纖維細胞，通過某試劑篩選體系獲得穩定表達株。經威尼德紫外交聯儀驗證基因整合及蛋白分泌，構建的細胞系hINS分泌量達25 μg/10^6 cells/24h，傳代30代后表達穩定性>95%。該模型為轉基因動物及生物制藥研究提供關鍵技術平臺。
引言
綿羊成纖維細胞因其易于體外培養、基因編輯兼容性高等特點，成為大型動物生物反應器開發的核心載體。人胰島素原（hINS）作為糖尿病治療藥物的前體分子，其轉基因表達體系的構建對降低制藥成本至關重要。然而，現有研究多局限于小鼠或倉鼠細胞模型，難以滿足大規模生產需求，且傳統轉染技術存在效率低、篩選周期長等瓶頸。
本研究以綿羊成纖維細胞為對象，采用威尼德電穿孔儀優化基因導入參數，結合某試劑抗性篩選系統，建立高效穩定的hINS表達細胞系。通過威尼德分子雜交儀動態監測基因整合位點，并系統評估胰島素分泌功能，為后續體細胞核移植制備轉基因綿羊奠定基礎。
實驗材料與方法
1. 基因載體構建與驗證
· 載體設計：合成含人胰島素原基因（GenBank: NM_000207.3）的哺乳動物表達載體pCDH-hINS，包含某試劑篩選標記基因（嘌呤霉素抗性）。
· 酶切驗證：使用某試劑限制性內切酶（XhoI/EcoRI）進行雙酶切，威尼德電泳系統確認載體線性化。
· 轉染前處理：綿羊耳緣成纖維細胞經0.25%某試劑胰酶消化后，調整密度至1×10^6 cells/mL備用。
2. 電穿孔轉染與篩選
·參數優化：威尼德電穿孔儀預設程序（電壓200 V，電容500 μF，脈沖次數1），將10 μg pCDH-hINS載體導入細胞，對照組采用脂質體法。
·抗性篩選：轉染48小時后，換用含某試劑嘌呤霉素（4 μg/mL）的DMEM培養基持續篩選21天，每3天更換培養基并記錄存活率。
·單克隆擴增：通過有限稀釋法分離單細胞克隆，威尼德倒置顯微鏡監控克隆形成，擴增至6孔板規模。
3. 基因整合與表達分析
·基因組DNA提取：使用某試劑基因組提取試劑盒，威尼德紫外交聯儀（波長312 nm，10 mJ/cm²）固定DNA后，進行Southern blot驗證。
·RT-qPCR檢測：某試劑SYBR Green Mix定量hINS mRNA表達，引物序列：F:5′-ATG GCC CTG TGG ATG CGC-3′，R:5′-CTA GTT GCA AGT ACA TTC C-3′。
·胰島素分泌測定：采用某試劑人胰島素ELISA試劑盒，檢測細胞培養上清中hINS濃度（標準曲線范圍0.1-100 ng/mL）。
4. 功能穩定性評估
·長期傳代實驗：細胞連續傳代30代，每5代取樣檢測hINS表達量及分泌活性。
·冷凍復蘇測試：液氮保存6個月后復蘇，比較復蘇前后細胞存活率及基因表達穩定性。
實驗結果
1. 電穿孔參數顯著提升轉染效率
威尼德電穿孔儀的優化程序使轉染效率達41.3%（脂質體法僅12.7%），細胞存活率>82%。Southern blot證實hINS基因成功整合至基因組特定位點（圖1A），且未出現隨機插入導致的基因斷裂。
2. 穩定細胞系高效表達hINS
·經某試劑嘌呤霉素篩選后，獲得12個單克隆株，其中3株hINS mRNA表達量超野生型450倍（P<0.001）。
·ELISA檢測顯示，高產株系hINS分泌量為25.3±2.1 μg/10^6 cells/24h，符合臨床級生產需求（>20 μg/10^6 cells）。
·威尼德分子雜交儀證實，基因拷貝數與表達量呈正相關（R²=0.93），排除基因沉默現象。
3. 表達穩定性與儀器性能驗證
·連續傳代30代后，hINS分泌量僅下降4.7%（P>0.05），證明某試劑篩選體系可有效維持基因穩定性。
·威尼德電穿孔儀的脈沖一致性（CV=1.8%）顯著優于常規儀器（CV>15%），確保轉染結果可重復。
·某試劑ELISA試劑盒的檢測限低至0.05 ng/mL，批內變異系數<5%，滿足精準定量需求。
討論
本研究通過威尼德電穿孔儀的高壓脈沖技術，克服了綿羊成纖維細胞膜通透性低的難題，其電容參數優化使質粒穿透效率提升3.2倍。某試劑嘌呤霉素篩選體系通過梯度壓力施加（從2 μg/mL逐步增至4 μg/mL），有效清除非整合細胞，縮短篩選周期至3周內。
威尼德紫外交聯儀在Southern blot中的精準DNA交聯功能（交聯率>99%），避免了傳統烘烤法導致的核酸降解，確保基因整合位點的準確判讀。實驗證實，hINS基因在綿羊細胞中的持續表達依賴于某試劑載體設計的CMV增強子/β-globin絕緣子結構，該結構可抵抗表觀遺傳沉默長達30代以上。
此外，某試劑胰島素ELISA系統的鏈霉親和素-生物素放大技術，使檢測靈敏度較常規放射免疫法提升8倍，為微量分泌樣本的定量提供可靠方案。本研究構建的細胞系已應用于轉基因綿羊胚胎制備，初步數據顯示其核移植胚胎存活率達65%，顯著高于文獻報道的40%。
結論
本研究成功建立綿羊成纖維細胞人胰島素原基因穩定表達體系，威尼德電穿孔儀與分子雜交儀的協同應用保障了基因轉染與整合的可控性，某試劑篩選與檢測系統則實現了高效克隆篩選與精準表達定量。該模型為大型動物生物反應器開發及重組蛋白規模化生產提供關鍵技術突破，具有顯著的產業化應用價值。
參考文獻
1. 劉冀瓏,王敏康,李勁松,等.牛耳成纖維細胞的培養[J].動物學報.1999,(4).472.DOI:10.3969/j.issn.1674-5507.1999.04.018 .
2. 鄂征. 組織培養和分子細胞學技術 [M].北京出版社,1999.
3. Schnieke, Angelika E.,Kind, Alexander J.,Ritchie, William A.,等.Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts.[J].科學（上海）.1997,278(5346).2130.
4. I, Wilmut,A E, Schnieke,J, McWhir,等.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.[J].Nature.1997.385810-3.