最近經(jīng)常有同學(xué)和小尚反映細胞復(fù)蘇不起來，復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)的一個常規(guī)操作，但其中有諸多細節(jié)容易被忽視，復(fù)蘇成敗和凍存、復(fù)蘇操作都密切相關(guān)，稍不注意就可能一失足成千古恨。

本篇主要從凍存角度進行分析，下周將更新復(fù)蘇操作的原因排查，歡迎同學(xué)們收藏追更~

我們先復(fù)習(xí)一下凍存步驟：

1. 提前準備好凍存液備用；

2. 離心獲得細胞沉淀后，加凍存液輕輕重懸細胞；

3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移入凍存管；

4. 如果使用程序凍存液，將凍存管放進程序凍存盒，放入-80℃冰箱過夜后液氮保存。如果使用非程序凍存液，則無需凍存盒。

▶凍存常見的錯誤操作

1. 使用常規(guī)含血清凍存液（培養(yǎng)基+血清+DMSO）時，沒有使用程序降溫凍存盒或泡沫盒等保溫措施。

降溫過快形成冰晶將導(dǎo)致細胞破裂死亡，常規(guī)含血清凍存液需要搭配凍存盒使用。現(xiàn)在市售的程序凍存盒可以確保溫度以1℃/min的速度緩慢下降。

沒有凍存盒的同學(xué)可以將凍存管放在泡沫盒中4℃靜置5-10min，再-20℃靜置2h后轉(zhuǎn)入-80℃過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存。

沒有凍存盒也沒有泡沫盒的同學(xué)，建議用無血清非程序凍存液。非程序凍存液含有更多的保護劑，可以直接重懸細胞后置于-80℃冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮。

2. 凍存前細胞狀態(tài)不好或凍存密度太低。

細胞狀態(tài)良好是復(fù)蘇成功前提，我們選擇對數(shù)生長期、匯合度80%以上的細胞進行凍存。如果凍存前細胞培養(yǎng)上清呈橘黃色，建議換液后靜置培養(yǎng)4h再凍存。

雖然凍存液含有保護劑，但冷凍過程中仍會有少量細胞死亡。因此凍存的密度不能太低，以200-300萬/mL/管為宜。如果不方便計數(shù)，可以按一個T25瓶凍存1-2管，一個10cm皿凍存2-3管（注意細胞是80%以上匯合度）。

3. 直接將DMSO加入細胞懸液而沒有提前配制凍存液

DMSO被稀釋時會放熱（好奇的同學(xué)下次配凍存液可以摸一下，小編也是偶然摸了才發(fā)現(xiàn)的），會對較脆弱的細胞造成損傷。好養(yǎng)的細胞也許沒有很大影響，但為了課題順利，咱還是不能偷懶哈~先配好凍存液，再去處理細胞。

4. 凍存液重懸細胞后直接放進液氮，沒有經(jīng)過-80℃冰箱

液氮的溫度是-196℃，未經(jīng)梯度降溫的細胞直接放進液氮，毫無疑問細胞會死亡。將細胞放液氮罐口降溫也不行哈。

5. 凍存液配方不合適

研究表明5%-10%的DMSO最適合細胞凍存，具體比例要根據(jù)細胞種類調(diào)整，對DMSO敏感的細胞則需要降低比例。根據(jù)小尚的經(jīng)驗，8% DMSO適用于大部分細胞系。

同時，還需根據(jù)細胞培養(yǎng)難度調(diào)整血清比例，越難養(yǎng)的細胞越要多加血清，過于脆弱的細胞可用血清+DMSO凍存，不加培養(yǎng)基。

無論用何種凍存液，都建議做凍檢再正式凍存：即凍存24h后復(fù)蘇一支，確認細胞狀態(tài)沒問題，即可進行大批量凍存。凍檢成功前要留至少一瓶細胞培養(yǎng)，以免復(fù)蘇失敗導(dǎo)致細胞絕種。

6. 凍存條件不當(dāng)或凍存時間太久

通常，液氮儲存的時限和穩(wěn)定性比-80℃冰箱要好很多。-80℃冰箱由于經(jīng)常會開關(guān)門，溫度不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致細胞活率下降比較快，因此細胞盡量液氮保存。

沒有液氮罐的同學(xué)，把凍存管放在-80℃冰箱靠里面的位置，定期復(fù)蘇檢測活性。

未完待續(xù)......