在生命科學的探索之路上，原核蛋白表達重要的技術手段。然而，在這個過程中，科研人員常常面臨諸多難點。比如，蛋白表達量低得讓人沮喪，好不容易進行實驗，卻發現經過漫長的等待后只得到微量的產物；或者蛋白錯誤折疊，形成難以處理的包涵體，使得后續的純化和研究工作舉步維艱；又或者在選擇宿主菌和表達載體時感到迷茫，如同在迷霧中摸索，不知哪一個組合才是最佳選擇。那么，如何破解這些難題呢？關鍵就在于正確選擇原核蛋白表達的宿主菌和表達載體。你選對了嗎？讓我們一同深入探討，尋找開啟成功原核蛋白表達之門的鑰匙。

原核表達常用載體

1、pET 系列載體：
優點：
高表達水平：是應用非常廣泛的一類原核表達載體，具有高拷貝數，能使目的基因在大腸桿菌中實現高水平表達，適合需要大量蛋白的實驗。
調控精確：利用 T7 啟動子系統，T7 RNA 聚合酶具有很強的轉錄活性，并且可以通過加入誘導劑（如 IPTG）來精確調控基因的表達，可調節基礎表達水平以優化目標基因的表達。
多種選擇：有多種載體–宿主菌組合可供選擇，并且有不同的融合標簽和表達系統配置，還包含可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌，能滿足不同的實驗需求。
克隆方便：許多載體以 LIC（連接非依賴的克隆）載體試劑盒提供，可用于迅速定向克隆 PCR 產物，操作相對簡便。
缺點：
基礎表達：在某些情況下可能會出現基礎表達水平較高的現象，對于一些對蛋白表達量和時間要求非常嚴格的實驗，需要更精確地控制表達條件。
復雜操作：部分載體的構建和操作相對復雜，需要對載體的特性和實驗操作有較好的理解和掌握。

2、pGEX 系列載體：
優點：
易于純化：利用 tac 啟動子，表達時會表達出包含谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）標簽的融合蛋白。GST 標簽可以與谷胱甘肽樹脂特異性結合，便于使用親和層析進行純化，然后再用凝血蛋白酶或者 factor Xa 因子切割融合蛋白去除標簽。
提高溶解性：GST 標簽有助于增加外源蛋白的溶解度，對于一些難溶性蛋白的表達有一定幫助，能夠提高蛋白的穩定性和可操作性。
嚴謹調控：該系列載體上有一個 lacIq 基因，能夠表達更多的阻遏蛋白以實現嚴謹的誘導調控，降低本底表達。
缺點：
標簽影響：GST 標簽相對較大，可能會對目的蛋白的結構和功能產生一定影響，在某些對蛋白純度要求極高的實驗中，去除標簽的步驟可能會增加操作復雜性和時間成本2。

3、pBAD 和 pAraB 系列載體2：
優點：
誘導表達：這些載體使用 araB 操縱子，可以用來在缺乏丙氨酸解氨酶的大腸桿菌突變株中，通過 L - 丙氨酸誘導目的基因的表達，誘導條件相對溫和，對細胞的毒性較小。
可調控性：可以根據加入的 L - 丙氨酸的濃度來調節基因的表達水平，實現一定程度的表達調控。
缺點：
表達水平：總體來說，其表達水平可能不如一些強啟動子的表達載體高，對于需要高產量蛋白的實驗可能不太適用。
宿主限制：需要特定的大腸桿菌突變株作為宿主，宿主的選擇范圍相對較窄。

4、pUC 系列載體：
優點：
高拷貝數：含有 pMB1 復制子，具有較高的拷貝數，平均每個細胞可達 500 - 700 個拷貝，有利于獲取大量的質粒。
篩選方便：具有來自大腸桿菌 lac 操縱子的 lacZ’基因，所編碼的 α- 肽鏈可參與 α- 互補作用，在 IPTG 誘導和底物 X-gal 存在下，可形成藍色和白色菌落，便于篩選重組體。
多克隆位點：具有多克隆位點區段（MCS），便于具有不同粘性末端的外源基因的插入，克隆操作相對簡單。
缺點：
表達量較低：主要是克隆載體，表達元件相對較少，表達水平相對其他專門的表達載體可能較低，一般更適合用于克隆和初步的基因操作5。

5、pBV220 系列載體：
優點：
溫度調控：含有 clts857 基因（cl 基因的溫度敏感突變體），該基因表達的 Cl 蛋白能夠抑制啟動子 Pr 和 Pl，又對溫度敏感。所以該系列載體可以用溫度對外源基因的轉錄進行調控，無需添加誘導劑，減少了誘導劑對細胞的潛在影響。
非融合表達：SD 序列后面緊跟著就是多克隆位點，便于帶有起始密碼子 ATG 的外源基因的插入并表達成非融合蛋白，有利于保持目的蛋白的天然結構和功能。
缺點：
熱休克影響：在溫度激活的過程中，大腸桿菌中的熱休克蛋白也會表達，可能會降解表達的外源蛋白，影響目的蛋白的產量和質量。
調控不精確：溫度調控相對不如誘導劑調控精確，且對實驗環境的溫度控制要求較高，需要精確的溫度控制設備來保證實驗的重復性。

6、pT7 系列載體：
優點：
強啟動子：以 T7 啟動子為核心，T7 啟動子具有非常高的轉錄效率，能夠驅動目的基因的高效表達，對于一些需要大量表達目的蛋白的實驗非常有利。

專一性強：T7 RNA 聚合酶只識別 T7 啟動子，具有很高的專一性，能夠避免其他雜蛋白的產生，提高目的蛋白的純度。

缺點：
宿主要求高：需要宿主細胞中含有 T7 RNA 聚合酶或者攜帶能夠表達 T7 RNA 聚合酶的基因，如大腸桿菌 BL21（DE3）等特定的菌株，對宿主細胞的要求較高。

毒性問題：在某些情況下，T7 啟動子的高表達能力可能會對宿主細胞產生一定的毒性，影響細胞的生長和存活，需要優化表達條件來降低毒性影響。

表達載體選擇的考慮因素

1、目的蛋白的特性：
蛋白大小：如果目的蛋白相對較小，可以選擇一般的高拷貝數載體，如 pUC 系列等；如果蛋白較大，可能需要選擇具有較強啟動子和翻譯效率的載體，以確保蛋白能夠順利表達。對于特別大的蛋白，還需考慮載體的承載能力和對蛋白表達的影響。
蛋白的疏水性：疏水性強的蛋白在表達過程中容易聚集形成包涵體，此時可選擇能促進蛋白可溶性表達的載體，如 pGEX 系列等。GST 標簽可以增加蛋白的溶解性，有助于提高疏水性蛋白的表達水平和可溶性。
是否含有特殊結構：例如含有較多二硫鍵的蛋白，在原核表達系統中正確形成二硫鍵可能存在困難。對于這類蛋白，需要選擇能夠提供合適氧化還原環境的宿主菌以及相應的表達載體，或者采用特殊的表達策略，如在較低溫度下進行誘導表達，以促進二硫鍵的正確形成。如果目的蛋白是膜蛋白，其表達和折疊需要特定的膜環境，選擇的載體和宿主菌應能夠在一定程度上模擬膜環境，或者選擇具有相關輔助蛋白的表達系統。

2、表達水平的需求：
強啟動子與高拷貝數：如果需要獲得高表達水平的蛋白，應選擇具有強啟動子的載體，如 pET 系列載體中的 T7 啟動子，能夠使目的基因在大腸桿菌中實現高水平的表達。同時，高拷貝數的載體也有助于提高蛋白的表達量，但也要注意過高的拷貝數可能會對宿主細胞造成負擔12。
誘導條件的適配性：一些載體的啟動子需要特定的誘導劑和誘導條件才能實現高效表達。例如，pTrc 系列載體的 Trc 啟動子可以通過色氨酸的濃度來調控目的基因的表達；pBAD 和 pAraB 系列載體利用阿拉伯糖操縱子，通過 L - 丙氨酸誘導目的基因的表達。根據實驗的便利性和對表達水平的精確調控需求，選擇合適的誘導系統1。

3、蛋白的純化需求：
純化標簽的選擇：常見的純化標簽有 His-tag（組氨酸標簽）、GST-tag（谷胱甘肽 S - 轉移酶標簽）、Flag-tag 等。His-tag 相對較小，對蛋白的結構和功能影響較小，并且可以通過鎳柱親和層析進行快速純化；GST-tag 較大，能提高蛋白的溶解性，但純化后可能需要去除標簽，且純化過程相對復雜一些。如果后續實驗對蛋白的純度要求較高，需要選擇與純化方法相適配的標簽和載體。
多標簽系統：有些情況下，為了便于蛋白的純化、檢測或其他操作，可以選擇帶有多個標簽的載體。例如，同時帶有 His-tag 和 Flag-tag 的載體，可以利用不同的純化方法進行驗證和純化，提高蛋白的純度和可靠性。

4、宿主菌的特性：

宿主菌的兼容性：不同的原核表達載體適用于不同的宿主菌。例如，pET 系列載體通常與大腸桿菌 BL21 (DE3) 等具有 T7 RNA 聚合酶系統的菌株配合使用，能夠實現高效表達；而一些特殊的宿主菌，如 Rosetta (DE3)，對稀有密碼子有較好的適應性，適合表達含有稀有密碼子的外源基因。在選擇載體時，要確保其與所使用的宿主菌相兼容。

宿主菌的生長特性和培養條件：宿主菌的生長速度、培養溫度、營養需求等因素也會影響表達載體的選擇。例如，有些宿主菌在高溫下生長良好，對于需要在較高溫度下表達的蛋白，可以選擇適合該溫度條件的宿主菌和載體；而對于一些對溫度敏感的蛋白，則需要選擇在較低溫度下生長的宿主菌，以避免蛋白的變性和降解。

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