電轉化外源質粒至干酪乳桿菌的研究
一、引言
二、材料與方法
（一）菌株與質粒
（一）電場強度對電轉化效率的影響 （二）脈沖時間對電轉化效率的影響 （三）質粒濃度對電轉化效率的影響 （四）細胞預處理對電轉化效率的影響
（一）菌株與質粒
- 菌株：本研究選用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[具體菌株編號] 作為宿主菌，該菌株購自 [菌種保藏機構名稱]。
- 質粒：采用具有特定篩選標記（如抗生素抗性基因）的外源質粒 [質粒名稱]，其構建和來源見 [相關文獻或實驗記錄]。
- 培養基
- MRS 培養基（de Man, Rogosa and Sharpe Medium）：用于干酪乳桿菌的培養與活化，其組成成分（g/L）為：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐溫 - 80 1.0，磷酸氫二鉀 2.0，乙酸鈉 5.0，檸檬酸三銨 2.0，硫酸鎂 0.58，硫酸錳 0.25，瓊脂 15.0（固體培養基添加），pH 6.2 - 6.4。
- SOC 培養基：用于電轉化后的細胞復蘇培養，其組成成分（g/L）為：蛋白胨 20.0，酵母膏 5.0，氯化鈉 0.5，氯化鉀 0.186，硫酸鎂 0.98，葡萄糖 3.6，pH 7.0。
- 試劑
- 電擊緩沖液：采用 10% 甘油 + 0.5 M 蔗糖溶液，用超純水配制，經 0.22 μm 濾膜過濾除菌后備用。
- 抗生素：根據質粒所攜帶的篩選標記，選用相應的抗生素（如氯霉素、紅霉素等），配制成適當濃度的儲存液，使用時按所需終濃度添加至培養基中。
- 電穿孔儀（[品牌型號]）：用于施加電擊脈沖，實現外源質粒的電轉化。
- 低溫離心機（[品牌型號]）：能夠在低溫條件下對細胞進行離心操作，以收集菌體和去除上清液等。
- 超凈工作臺：提供無菌操作環境，防止雜菌污染實驗樣品。
- 恒溫培養箱：用于培養干酪乳桿菌，控制培養溫度在 37°C。
- 將 - 80°C 保存的干酪乳桿菌甘油菌劃線接種于 MRS 固體培養基平板上，37°C 培養 24 - 48 h，至長出單菌落。
- 挑取單菌落接種至 5 mL MRS 液體培養基中，37°C、180 r/min 振蕩培養過夜，獲得種子液。
- 以 1%（v/v）的接種量將種子液轉接至 50 mL MRS 液體培養基中，繼續培養至對數生長期中期（OD₆₀₀約為 0.4 - 0.6）。
- 收集菌體：將培養好的菌液置于冰上預冷 10 min，然后在 4°C、5000 r/min 條件下離心 10 min，棄去上清液。
- 細胞洗滌：用預冷的電擊緩沖液重懸菌體，再次離心（4°C、5000 r/min、10 min），重復洗滌 2 - 3 次，以去除培養基殘留成分對電轉化的影響。
- 細胞預處理：最后一次洗滌后，用適量的電擊緩沖液重懸菌體，調整細胞濃度至約 1×10¹⁰ - 1×10¹¹ CFU/mL。對于部分實驗組，在重懸時添加一定濃度的外源物質（如甘氨酸、氯化鎂等），在冰上孵育 30 - 60 min，以改變細胞壁通透性，提高電轉化效率。
- 采用堿裂解法提取外源質粒 [質粒名稱]，具體操作步驟參照 [分子克隆實驗指南等相關文獻]。提取后的質粒經瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性，并使用核酸定量儀測定質粒濃度。
- 將提取的質粒稀釋至不同濃度梯度（如 1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL 等），備用。
- 取 100 μL 預處理后的菌體與不同體積（如 1 μL、5 μL、10 μL 等）和濃度的外源質粒混合，輕輕混勻后轉移至預冷的電穿孔杯中（電極間距 0.2 cm）。
- 將電穿孔杯置于電穿孔儀中，設置不同的電轉化參數，包括電場強度（如 1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm 等）、脈沖時間（如 3 ms、5 ms、10 ms 等）和脈沖次數（一般為 1 - 3 次）。
- 施加電擊脈沖后，立即向電穿孔杯中加入 900 μL SOC 培養基，輕輕混勻，然后將菌液轉移至 1.5 mL 無菌離心管中。
- 37°C、180 r/min 振蕩培養 2 - 3 h，使細胞復蘇并表達質粒所攜帶的抗性基因。
- 復蘇培養后的菌液進行適當稀釋（如 10⁻¹ - 10⁻⁶ 倍），取 100 μL 稀釋后的菌液涂布于含有相應抗生素的 MRS 固體培養基平板上，37°C 培養 48 - 72 h，直至長出可見菌落。
- 統計平板上的菌落數，并根據稀釋倍數計算轉化效率，公式為：轉化效率（CFU/μg DNA）=(轉化子菌落數 × 稀釋倍數)/(質粒 DNA 加入量（μg）)。
（一）電場強度對電轉化效率的影響 （二）脈沖時間對電轉化效率的影響 （三）質粒濃度對電轉化效率的影響 （四）細胞預處理對電轉化效率的影響
- 甘氨酸預處理：在重懸菌體時添加不同濃度（0.5%、1.0%、2.0%）的甘氨酸，在冰上孵育 30 min 后進行電轉化實驗。結果表明，甘氨酸預處理能夠顯著提高電轉化效率，其中 1.0% 甘氨酸處理組的轉化效率最高，相比未處理組提高了約 [Z] 倍。甘氨酸能夠削弱細胞壁中的肽聚糖交聯，增加細胞壁的通透性，從而有利于外源質粒進入細胞。但甘氨酸濃度過高時，可能會導致細胞壁過度破壞，影響細胞的完整性和存活率，進而降低轉化效率。
- 氯化鎂預處理：添加不同濃度（5 mM、10 mM、20 mM）的氯化鎂進行細胞預處理，實驗結果顯示，10 mM 氯化鎂處理組的電轉化效率有所提高，比未處理組提高了約 [A]%。氯化鎂可能通過影響細胞膜的穩定性和表面電荷分布，促進外源質粒與細胞膜的相互作用，從而提高轉化效率。然而，過高濃度的氯化鎂可能會引起細胞內滲透壓的改變，對細胞產生不良影響。
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