在使用Teledyne ISCO的CombiFlash^®系統時，或者在純化沒有色團的化合物時，可以使用薄層色譜法（TLC）來定位收集到的餾分中的純化化合物。

如果已知化合物的保留因子（R_f），則可以根據柱體積估計含有所需物質的餾分收集管。柱體積是裝填柱的空隙（空余）體積。這一規格在所有RediSep^®色譜柱的色譜應用說明3中都有列出。

了解R_f和柱體積可以讓您大致了解化合物可能位于哪些餾分收集管的范圍。

二、一般方法    

將待分離的化合物加載到TLC板上，并分離成幾個種類。

控制參數    

TLC的幾個參數必須保持一致以獲得良好的相關性。

• TLC溶劑應以體積比的方式量取，以便混合物在轉移到梯度生成系統時保持恒定。

• 為了獲得最佳結果，建議對層析室和板進行平衡。

• 推薦將板運行至距離板頂部1-4厘米以內，以實現良好的分離。

• 在運行板之前，應標記樣品斑點位置和溶劑水平。

• 應在運行結束時標記溶劑洗脫高度和樣品斑點位置。

• 在進行TLC時，層析室中的溶劑水平絕不能觸及樣品，并且應覆蓋層析室以維持氣相中的平衡。

假設    

有幾個假設：

• 色譜柱和TLC板使用相同類型的固定相。

• TLC方法中使用的溶劑與液體分離中使用的溶劑相同。

因此，液體分離必須是等度洗脫。

• TLC的Rf應小于0.5且大于0.1，如果不是這樣，則可能需要不同的溶劑系統。

R_f值    

R_f — 保留因子。樣品斑點移動的距離。Rf通過以下公式計算：

   

Z_x — 斑點從其起始點（樣品線）移動的距離。請參考圖1和圖2。

Z_f — 從原始溶劑線到最終溶劑前沿的距離。

Z₀ — 從溶劑線到樣品線的距離。

圖1：TLC起始

   

圖2：TLC完成

柱體積相關性    

一旦知道了混合物中某個組分的R_f，就可以與柱體積（CV）建立相關性。 

如果R_f值在0.1和0.5之間，它可以被輸入到以下公式中，以給出收集管的范圍。

   

Volc — 柱的空隙體積。

Volf — 每個管中收集的餾分體積。

三、示例

請參考圖3。

   
圖3：TLC示例

一個丙酮斑點洗脫了62毫米（Z_x=62毫米），溶劑水平到水平樣品線的距離是8毫米（Z₀=8毫米），溶劑前沿移動的距離是170毫米（Z_f=170毫米）。R_f是無量綱的，所以單位被省略，進行計算：

   

   

   

四、計算機

人們可以輕松使用Microsoft^® Excel^®或其他電子表格程序來創建Rf和試管相關性計算器：

   

圖4：R_f和試管相關性計算器

五、參考    

Colin F. Poole and Salwa K. Poole, “Chromatography Today”, Elsevier Science Publishers B.V., 649-667, (1991).