反向找靶案例之中藥單體和靶點的結合模式預測及驗證
之前，小陶介紹了一種反向靶點發現算法——COMET，并使用了 Apiopaeonoside 和 Sciadopitysin 兩種中藥單體進行了操作演示。
接下來，讓我們一起回顧一下之前的實驗結果，并探討后續推薦的實驗思路。
結果分析思路
Apiopaeonoside 反向找靶的結果如下圖所示：
假設本次實驗發現 Apiopaeonoside 能治療慢性阻塞性肺疾病、高血壓，而預測的第一個靶點 Epoxide hydrolase 剛好和這兩種疾病相關，所以，第一個靶點雖然打分（Probability）較低，但是，其仍然值得我們嘗試后續的實驗。
Sciadopitysin反向找靶結果如下圖所示：
假設 Sciadopitysin 有治療卵巢癌的效果，那么 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 打分雖然不如 Poly [ADP-ribose] polymerase-1 好，但是，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 和卵巢癌息息相關，所以，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 仍然是我們首先考慮的靶點。
后續實驗驗證
根據假設，目前已經得到了兩個分子可能的靶點。后續一般可以用 分子親合力實驗 來證明小分子和蛋白確實是有結合的，比如SPR（表面等離子體共振技術）、MST（微量熱泳動技術）。實驗需要用到純化蛋白和小分子單體及對應的儀器，蛋白和小分子陶術生物都可以提供，如果沒有實驗儀器，也可以找陶術生物來做驗證實驗！
除上述說的濕實驗驗證方法外，也可以嘗試采用動力學作為補充實驗。如黃以超團隊在“Environmentally realistic dose of tire-derived metabolite 6PPD-Q exposure causes intestinal jejunum and ileum damage in mice via cannabinoid receptor-activated inflammation ”中所做實驗一樣。
分子動力學模擬
本次實驗將以 Sciadopitysin 和 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 復合物結構為演示，采用 Amber24/Ambertool24 進行分子動力學模擬實驗。本次實驗細節內容將在陶術小課堂中展示。內容較多，會分步介紹，歡迎掃碼關注~
蛋白體系的準備
首先，我們對得到的結構進行調整，我們需要注意以下7點：
A Non-Standard Residues
B Metals
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
D Solvent molecules or crystallization buffer
E Missing electron density (amino acids)
F Disulfide Bonds
G Protonation States
A Non-Standard Residues
Non-Standard Residues（非標準殘基）是指PDB中20種天然氨基酸以外的其它氨基酸或者分子，包括輔因子（NADH、血紅素等）、非標準氨基酸（羥脯氨酸等）、抑制劑/激動劑或底物。如果有任何非標準氨基酸，我們應該考慮如何對這些殘基進行建模。對于不含金屬或類金屬的小有機分子，構建其結構和使用antechamber一樣簡單。對于更復雜的非標準殘基，需要使用別的方法。
B Metals
金屬的處理比較復雜，如果復合物結構中包含金屬，應該仔細考慮如何對其建模。可以參考amber軟件手冊。或者在以下兩個位置查看軟件目前已有的金屬力場$AMBERHOME/dat/leap/lib 和 $AMBERHOME/dat/leap/parm。
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
使用PDB晶體結構的時候，一定要好好閱讀一下對應的文獻，并注意任何重要的結構特征（比如二硫鍵）。還要注意用于解析結構的實驗程序。有任何問題，都可以直接編輯PDB文件來修復。注意以下幾點：
在某些情況下，溶劑或結晶緩沖液可能與蛋白質一起結晶，并包含在PDB文件中。因為我們后續采用顯式溶劑體系，所以我們可以保留結晶水。PDB文件里有時會出現其他溶劑或磷酸鹽。這些不會影響蛋白質的功能，因此可以將其去除。
E Missing electron density (amino acids)
有時，PDB缺少電子密度，但是，在實際實驗中，必須要補全缺失的氨基酸。可以采用以下操作查看蛋白是否完整：
在晶體結構對應的論文中，可以了解結構的全貌，在VMD中看到蛋白質結構。Amber中對參與二硫鍵的半胱氨酸以CYX代替CYS。
G Protonation States
請記住，我們的最終目標是模擬現實，這可能不一定反映在PDB結構中。其中一個重要的例子是質子化狀態。蛋白質含有幾種非標準質子化狀態的氨基酸。例如，天冬氨酸蛋白酶在其活性位點有一個質子化的天冬氨酸殘基。在嘗試模擬蛋白質之前，你應該知道你的蛋白質及其功能，你應該了解它是否需要任何非標準的質子化狀態。
用X射線方法解析的的晶體結構不含氫，因為該方法無法解析。LEaP根據最佳氫鍵自動向這些結構中添加氫，同時遵循標準質子化狀態。因此，如果不進行必要的重新命名更改，具有非標準質子化狀態的氨基酸將被錯誤質子化。
例如，在天冬氨酸蛋白酶的PDB中，質子化的天冬氨酸將以Asp的重新命名，就像所有其他羧酸天冬氨酸一樣。這將導致LEaP質子化，就像它是一種普通的天冬氨酸一樣。為了防止這種情況，必須將非標準Asp的別名更改為ASH（質子化Asp的昵稱）。使用正確的別名，LEaP將正確質子化您的氨基酸。表1顯示了一些常見質子化狀態的別名
Table 1. AMBER Resnames of Common Non-standard Protonation States
蛋白結構本身沒有問題后，可以進行后續的操作。
小分子結構準備
準備好的小分子還在蛋白結構中，我們對其小分子進行準備，通過以下命令生成化合物的拓撲文件。
antechamber -i lig1.mol2 -fi mol2 -o lig.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2
其中antechamber是調用的程序，-i是輸入，-f是格式，-o是輸出，-c bcc是采用AM1-BCC電荷模型計算原子點電荷，-s 2是提供verbosity狀態信息
parmchk2 -i lig.mol2 -f mol2 -o lig.frcmod
其中lig.frcmod是一個參數文件，可以加載到LEaP中以添加缺失的參數。這里它將包含所有缺失的參數。
tleap -f tleap_lig.in
對應的腳本可以從官網，或者私信獲得。
復合物結構的準備
將復合物結構中化合物的編號改為LIG。
輸入如下命令，添加離子中和體系電荷、加入水和0.15M的NaCl
tleap -f tleap_complex.in #隱式溶劑模型
tleap -f tleap_ion_water.in #顯式溶劑模型
需要計算電荷，可以參考腳本。
體系弛豫
輸入命令：
bash all_relax.scr
注意，對應的 min.in 腳本提前準備好，可以從官網下載也可以，另外腳本如果沒有執行權限，記得用 chmod 加上權限。對應的解釋可以在官網或者私信。
運行動力學
輸入命令：
bash jobfile_production.sh
對應的md.in腳本可以從官網獲取，也可私信。
目前，已經做好全部的動力學模擬實驗，后續等待結果，最后。可以做一些分析，如下：
接下來，讓我們一起回顧一下之前的實驗結果，并探討后續推薦的實驗思路。
結果分析思路
Apiopaeonoside 反向找靶的結果如下圖所示：
假設本次實驗發現 Apiopaeonoside 能治療慢性阻塞性肺疾病、高血壓，而預測的第一個靶點 Epoxide hydrolase 剛好和這兩種疾病相關，所以，第一個靶點雖然打分（Probability）較低，但是，其仍然值得我們嘗試后續的實驗。
Sciadopitysin反向找靶結果如下圖所示：
假設 Sciadopitysin 有治療卵巢癌的效果，那么 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 打分雖然不如 Poly [ADP-ribose] polymerase-1 好，但是，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 和卵巢癌息息相關，所以，Poly [ADP-ribose] polymerase 2 仍然是我們首先考慮的靶點。
后續實驗驗證
根據假設，目前已經得到了兩個分子可能的靶點。后續一般可以用 分子親合力實驗 來證明小分子和蛋白確實是有結合的，比如SPR（表面等離子體共振技術）、MST（微量熱泳動技術）。實驗需要用到純化蛋白和小分子單體及對應的儀器，蛋白和小分子陶術生物都可以提供，如果沒有實驗儀器，也可以找陶術生物來做驗證實驗！
除上述說的濕實驗驗證方法外，也可以嘗試采用動力學作為補充實驗。如黃以超團隊在“Environmentally realistic dose of tire-derived metabolite 6PPD-Q exposure causes intestinal jejunum and ileum damage in mice via cannabinoid receptor-activated inflammation ”中所做實驗一樣。
分子動力學模擬
本次實驗將以 Sciadopitysin 和 Poly [ADP-ribose] polymerase 2 復合物結構為演示，采用 Amber24/Ambertool24 進行分子動力學模擬實驗。本次實驗細節內容將在陶術小課堂中展示。內容較多，會分步介紹，歡迎掃碼關注~
首先，我們對得到的結構進行調整，我們需要注意以下7點：
A Non-Standard Residues
B Metals
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
D Solvent molecules or crystallization buffer
E Missing electron density (amino acids)
F Disulfide Bonds
G Protonation States
A Non-Standard Residues
Non-Standard Residues（非標準殘基）是指PDB中20種天然氨基酸以外的其它氨基酸或者分子，包括輔因子（NADH、血紅素等）、非標準氨基酸（羥脯氨酸等）、抑制劑/激動劑或底物。如果有任何非標準氨基酸，我們應該考慮如何對這些殘基進行建模。對于不含金屬或類金屬的小有機分子，構建其結構和使用antechamber一樣簡單。對于更復雜的非標準殘基，需要使用別的方法。
B Metals
金屬的處理比較復雜，如果復合物結構中包含金屬，應該仔細考慮如何對其建模。可以參考amber軟件手冊。或者在以下兩個位置查看軟件目前已有的金屬力場$AMBERHOME/dat/leap/lib 和 $AMBERHOME/dat/leap/parm。
C Experimental methods noted in the paper associated with the PDB
使用PDB晶體結構的時候，一定要好好閱讀一下對應的文獻，并注意任何重要的結構特征（比如二硫鍵）。還要注意用于解析結構的實驗程序。有任何問題，都可以直接編輯PDB文件來修復。注意以下幾點：
- 第一列中的HEATM標簽意味著這些殘基默認情況下不會通過鍵與周圍的氨基酸連接。查找/替換HEATM為“ATOM”，使序列連續。請確保保留ATOM后面的兩個空格，以便其余列將排列整齊。
- 第二列是原子序號，不要修改
- 第三列是原子的名稱。例如，CA是α-碳。因為蛋氨酸不含硒，如果存在，我們需要將這個原子變成硫。將原子名稱從SE編輯為SD（蛋氨酸中硫原子的原子名稱）。將最后一列中的SE也更改為S。
- 第四列是上面提到的殘基名稱。將所有MSE條目更改為MET。
在某些情況下，溶劑或結晶緩沖液可能與蛋白質一起結晶，并包含在PDB文件中。因為我們后續采用顯式溶劑體系，所以我們可以保留結晶水。PDB文件里有時會出現其他溶劑或磷酸鹽。這些不會影響蛋白質的功能，因此可以將其去除。
E Missing electron density (amino acids)
有時，PDB缺少電子密度，但是，在實際實驗中，必須要補全缺失的氨基酸。可以采用以下操作查看蛋白是否完整：
- 使用VMD顯示蛋白質骨架，并尋找任何缺失。
- 或者，您可以在PDB文件中查找缺失的殘基。
在晶體結構對應的論文中，可以了解結構的全貌，在VMD中看到蛋白質結構。Amber中對參與二硫鍵的半胱氨酸以CYX代替CYS。
G Protonation States
請記住，我們的最終目標是模擬現實，這可能不一定反映在PDB結構中。其中一個重要的例子是質子化狀態。蛋白質含有幾種非標準質子化狀態的氨基酸。例如，天冬氨酸蛋白酶在其活性位點有一個質子化的天冬氨酸殘基。在嘗試模擬蛋白質之前，你應該知道你的蛋白質及其功能，你應該了解它是否需要任何非標準的質子化狀態。
用X射線方法解析的的晶體結構不含氫，因為該方法無法解析。LEaP根據最佳氫鍵自動向這些結構中添加氫，同時遵循標準質子化狀態。因此，如果不進行必要的重新命名更改，具有非標準質子化狀態的氨基酸將被錯誤質子化。
例如，在天冬氨酸蛋白酶的PDB中，質子化的天冬氨酸將以Asp的重新命名，就像所有其他羧酸天冬氨酸一樣。這將導致LEaP質子化，就像它是一種普通的天冬氨酸一樣。為了防止這種情況，必須將非標準Asp的別名更改為ASH（質子化Asp的昵稱）。使用正確的別名，LEaP將正確質子化您的氨基酸。表1顯示了一些常見質子化狀態的別名
| Non-standard Protonation Form | AMBER Resname |
| Protonated/uncharged Asp | ASH |
| Protonated/uncharged Glu | GLH |
| Deprotonated/uncharged Lys | LYN |
| His protonated at epsilon position | HIE |
| His protonated at delta position | HID |
| Charged His (protonated at both positions) | HIP |
| Deprotonated Cys or Cys bound to a metal | CYM |
| Cys involved in disulfide bridge | CYX |
蛋白結構本身沒有問題后，可以進行后續的操作。
小分子結構準備
準備好的小分子還在蛋白結構中，我們對其小分子進行準備，通過以下命令生成化合物的拓撲文件。
antechamber -i lig1.mol2 -fi mol2 -o lig.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2
其中antechamber是調用的程序，-i是輸入，-f是格式，-o是輸出，-c bcc是采用AM1-BCC電荷模型計算原子點電荷，-s 2是提供verbosity狀態信息
▲輸出之后對應的界面
▲完成的界面
parmchk2 -i lig.mol2 -f mol2 -o lig.frcmod
其中lig.frcmod是一個參數文件，可以加載到LEaP中以添加缺失的參數。這里它將包含所有缺失的參數。
tleap -f tleap_lig.in
對應的腳本可以從官網，或者私信獲得。
復合物結構的準備
將復合物結構中化合物的編號改為LIG。
▲復合物結構的修改
輸入如下命令，添加離子中和體系電荷、加入水和0.15M的NaCl
tleap -f tleap_complex.in #隱式溶劑模型
tleap -f tleap_ion_water.in #顯式溶劑模型
需要計算電荷，可以參考腳本。
體系弛豫
輸入命令：
bash all_relax.scr
注意，對應的 min.in 腳本提前準備好，可以從官網下載也可以，另外腳本如果沒有執行權限，記得用 chmod 加上權限。對應的解釋可以在官網或者私信。
運行動力學
輸入命令：
bash jobfile_production.sh
對應的md.in腳本可以從官網獲取，也可私信。
目前，已經做好全部的動力學模擬實驗，后續等待結果，最后。可以做一些分析，如下：
動力學結果樣圖
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