在生命科學的探索之路上，原核蛋白表達重要的技術手段。然而，在這個過程中，科研人員常常面臨諸多難點。比如，蛋白表達量低得讓人沮喪，好不容易進行實驗，卻發(fā)現經過漫長的等待后只得到微量的產物；或者蛋白錯誤折疊，形成難以處理的包涵體，使得后續(xù)的純化和研究工作舉步維艱；又或者在選擇宿主菌和表達載體時感到迷茫，如同在迷霧中摸索，不知哪一個組合才是最佳選擇。那么，如何破解這些難題呢？關鍵就在于正確選擇原核蛋白表達的宿主菌和表達載體。你選對了嗎？讓我們一同深入探討，尋找成功開啟原核蛋白表達之門的鑰匙。

原核表達常用宿主菌

1. 大腸桿菌（Escherichia coli）：

優(yōu)點：

生長快速且培養(yǎng)簡單：大腸桿菌是一種生長速度極快的細菌，在適宜的條件下，如使用 LB 培養(yǎng)基，在 37℃下培養(yǎng)，其細胞數量可以在短時間內快速增加，一般幾個小時就能達到較高的密度，這有利于快速獲得大量的表達蛋白。而且對培養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)條件的要求不高，培養(yǎng)成本低廉。

遺傳背景清楚：作為一種被廣泛研究的模式生物，大腸桿菌的基因組信息已經被深入研究和了解，其遺傳操作方法成熟，便于進行基因工程改造和蛋白表達的調控。

表達水平高：具有較強的蛋白表達能力，能夠高效地表達外源基因，適用于小到中等大小的蛋白表達，對于大規(guī)模生產重組蛋白具有重要意義。

可選擇的表達載體和菌株豐富：有多種不同的表達載體可供選擇，如 pET 系列、pGEX 系列等，這些載體具有不同的啟動子、標簽和篩選標記等，可以根據實驗需求進行選擇。同時，也有多種大腸桿菌菌株經過改造和優(yōu)化，適用于不同的表達需求，如 BL21 (DE3)、JM109、W3110、Origami、Rosetta 等。

缺點：

缺乏真核細胞的翻譯后修飾能力：原核生物的翻譯后修飾系統(tǒng)與真核生物有很大的差異，大腸桿菌無法進行如糖基化、磷酸化、乙酰化等復雜的翻譯后修飾，這可能會影響某些蛋白的活性和功能。

易形成包涵體：在表達一些蛋白時，由于蛋白的折疊和組裝過程受到影響，容易形成不溶性的包涵體，這不僅會降低蛋白的表達量，還需要額外的步驟進行包涵體的變性和復性，增加了實驗的復雜性和難度。

產生內毒素：大腸桿菌會產生內毒素（脂多糖），內毒素的存在可能會影響蛋白的純度和質量，并且在一些應用中，如藥物研發(fā)和生產，內毒素的去除是一個必要的步驟，這增加了下游處理的成本和難度。

2. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：

優(yōu)點：

分泌表達能力強：具有較強的分泌表達能力，能夠將表達的蛋白分泌到細胞外，這有利于蛋白的分離和純化，減少了細胞破碎等操作步驟，提高了蛋白的純度和產量。

不產生內毒素：與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌不產生內毒素，因此在生物安全性方面具有一定的優(yōu)勢，特別適用于對生物安全性要求較高的蛋白質表達。

蛋白折疊正確：細胞內的環(huán)境有利于蛋白的正確折疊，能夠表達出具有正確構象和活性的蛋白，對于一些需要正確折疊才能發(fā)揮功能的蛋白，枯草芽孢桿菌是一個較好的選擇。

具有一定的抗逆性：能夠在較為惡劣的環(huán)境條件下生長，如高溫、高鹽等，這使得在一些特殊的培養(yǎng)條件下進行蛋白表達成為可能。

缺點：

表達效率相對較低：與大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌的蛋白表達效率相對較低，需要較長的時間才能獲得足夠量的蛋白，這可能會增加實驗的周期和成本。

遺傳操作相對復雜：雖然枯草芽孢桿菌的遺傳操作技術也在不斷發(fā)展，但相對于大腸桿菌來說，其遺傳操作仍然較為復雜，需要較高的技術水平和經驗。

可能存在蛋白酶降解：枯草芽孢桿菌細胞內存在一些蛋白酶，可能會對表達的蛋白進行降解，從而影響蛋白的產量和質量，需要采取一些措施來抑制蛋白酶的活性。

3. 乳酸菌（Lactococcus lactis）：

優(yōu)點：

安全性高：乳酸菌是一種常見的益生菌，對人體和動物無害，因此在食品和醫(yī)藥領域的應用具有較高的安全性。

適合表達分泌型蛋白：具有良好的分泌表達系統(tǒng)，能夠將表達的蛋白分泌到細胞外，便于蛋白的提取和純化，并且分泌的蛋白通常具有較好的穩(wěn)定性。

可進行食品級表達：在食品工業(yè)中，乳酸菌可以作為一種食品級的表達宿主，用于生產食品添加劑、酶制劑等，不需要進行復雜的下游處理和去除內毒素等步驟。

缺點：

表達水平有限：乳酸菌的蛋白表達水平相對較低，對于需要大量生產蛋白的實驗可能不太適用。

培養(yǎng)條件苛刻：乳酸菌對培養(yǎng)條件有一定的要求，如需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度等，這增加了實驗的操作難度和成本。

4. 沙門氏菌（Salmonella）：

優(yōu)點：

免疫原性強：作為一種病原菌，沙門氏菌具有較強的免疫原性，表達的蛋白可以作為疫苗的候選抗原，用于疫苗的研發(fā)和生產。

能夠表達一些在真核環(huán)境中難以表達的蛋白：對于一些在真核細胞中難以表達的蛋白，沙門氏菌可能具有一定的優(yōu)勢，能夠實現這些蛋白的表達。

缺點：

安全性問題：沙門氏菌是一種病原菌，在操作過程中需要嚴格的安全防護措施，以防止細菌的泄漏和感染，這增加了實驗的風險和難度。

表達系統(tǒng)復雜：沙門氏菌的表達系統(tǒng)相對較為復雜，需要對細菌的生長和表達條件進行精確的控制，否則可能會影響蛋白的表達效率和質量。

5. 藍細菌（Cyanobacteria）：

優(yōu)點：

光合作用能力：藍細菌具有光合作用能力，能夠利用光能進行生長和代謝，因此在培養(yǎng)過程中不需要添加有機碳源，降低了培養(yǎng)成本，并且對環(huán)境友好。

易于基因操作：隨著基因工程技術的發(fā)展，藍細菌的基因操作技術也逐漸成熟，能夠方便地進行外源基因的導入和表達調控。

可大規(guī)模培養(yǎng)：可以在光生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，具有較高的生產潛力，適用于大規(guī)模生產重組蛋白。

缺點：

生長速度較慢：與大腸桿菌等細菌相比，藍細菌的生長速度較慢，這可能會影響蛋白的生產效率。

蛋白表達量不穩(wěn)定：藍細菌的蛋白表達量受到多種因素的影響，如光照強度、溫度、營養(yǎng)條件等，因此蛋白表達量的穩(wěn)定性較差，需要對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化和控制。

宿主菌選擇的考慮因素

1. 蛋白表達量：

如果需要大量表達目標蛋白，例如用于大規(guī)模生產或需要高產量的實驗，可選擇具有高拷貝數質粒且蛋白表達能力強的菌株，如大腸桿菌 BL21 (DE3) 系列。這些菌株經過改造，能夠高效表達外源基因，適合對表達量要求較高的情況。

對于一些對表達量要求不高，但需要精確控制表達水平的實驗，例如研究蛋白的功能或進行結構分析，可能需要選擇表達水平相對較低但可調控性較強的菌株，如帶有嚴謹調控系統(tǒng)的菌株。

2. 蛋白的特性：

蛋白大小：對于小到中等大小的蛋白，大多數原核宿主菌都能較好地表達。但如果是較大的蛋白（如分子量超過 100 kDa），可能需要選擇具有特殊機制來幫助蛋白正確折疊和組裝的宿主菌，比如一些能夠增強分子伴侶表達的菌株，以提高大蛋白的表達效率和正確折疊。

是否含特殊結構或修飾：如果目標蛋白需要形成二硫鍵以獲得正確的折疊和活性，那么應選擇有利于二硫鍵形成的菌株，如 K-12 衍生菌 Origami2 系列等。這些菌株的細胞質是相對氧化的環(huán)境，可以促進二硫鍵的形成，能夠提高蛋白的可溶性及活性。如果蛋白需要進行糖基化等特殊修飾，原核宿主菌一般不能滿足需求，需要選擇真核表達系統(tǒng)，但在一些研究中，如果只是需要初步驗證蛋白的功能，原核表達系統(tǒng)也可以作為一種選擇，不過要注意蛋白的修飾情況可能與天然狀態(tài)不同。

3. 宿主菌的遺傳特性：

密碼子偏好性：真核細胞和原核細胞的密碼子偏好性有所不同，當用原核系統(tǒng)表達真核基因時，真核基因中的一些密碼子對于原核細胞來說可能是稀有密碼子，從而導致表達效率和表達水平很低。此時，可以選擇攜帶稀有密碼子對應 tRNA 的宿主菌，如 Rosetta 系列菌株，能夠補充大腸桿菌缺乏的稀有密碼子對應的 tRNA，提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。

蛋白酶特性：有些宿主菌內源的蛋白酶過多，可能會降解外源表達產物，導致蛋白不穩(wěn)定。因此，對于容易被蛋白酶降解的蛋白，應選擇蛋白酶缺陷型菌株作為宿主菌，如 BL21 系列就是 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型，是比較理想的起始表達菌株。

基因的兼容性：要確保宿主菌的基因組與外源基因的兼容性，避免出現基因沉默、不兼容等問題。例如，某些宿主菌可能對特定的 DNA 序列或基因結構存在排斥或不識別的情況，在選擇宿主菌時需要考慮這一點。

4. 安全性和生物相容性：

內毒素的產生：如果表達的蛋白用于醫(yī)療或生物制品等對安全性要求較高的領域，需要考慮宿主菌產生內毒素的情況。大腸桿菌通常會產生內毒素，而一些其他的原核宿主菌，如乳酸桿菌，不產生內毒素，對于生物安全性要求較高的蛋白質表達適用。

宿主菌的致病性：某些原核宿主菌具有致病性，在實驗操作和后續(xù)應用中可能存在安全風險，需要謹慎選擇。例如，傷寒沙門氏菌雖然可以用于蛋白表達，但處理要求更為復雜，相對較少被使用。

5. 培養(yǎng)條件和生長特性：

培養(yǎng)成本和難度：一些宿主菌的培養(yǎng)條件較為簡單，生長速度快，培養(yǎng)成本低，如大腸桿菌，易于在實驗室中進行大規(guī)模培養(yǎng)和操作；而有些菌株可能需要特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，增加了實驗的成本和難度。在選擇宿主菌時，需要考慮實驗室的培養(yǎng)條件和成本預算。

生長速度：對于需要快速獲得蛋白的實驗，選擇生長速度快的宿主菌可以縮短實驗周期。一般來說，大腸桿菌等常見的原核宿主菌生長速度較快，能夠在較短時間內達到較高的細胞密度，有利于蛋白的表達。

6. 與表達載體的兼容性：

抗生素抗性：表達載體通常攜帶抗生素抗性基因，用于篩選轉化成功的宿主菌。在選擇宿主菌時，要確保其抗生素抗性與表達載體相匹配，例如，如果表達載體攜帶氨芐青霉素抗性基因，那么宿主菌應具有對氨芐青霉素的敏感性，以便通過添加氨芐青霉素來篩選陽性克隆。同時，也要注意一些宿主菌可能本身已經攜帶某種抗生素抗性，避免使用相同的抗生素進行篩選。

啟動子的兼容性：不同的表達載體可能使用不同的啟動子，而宿主菌需要具有與啟動子相匹配的轉錄機制才能實現基因的有效表達。例如，某些表達載體使用 T7 啟動子，就需要選擇含有 T7 RNA 聚合酶的宿主菌，如 BL21 (DE3) 等。

逐典生物定制化原核蛋白表達服務

上海逐典生物的科學家團隊在定制原核蛋白領域潛心鉆研十余年，積累了極為豐富的分子設計、蛋白篩選以及工藝開發(fā)經驗。迄今，已成功交付了數百種細胞因子和定制酶。逐典生物定制化原核蛋白表達服務以先進的技術平臺為支撐，其中人工智能驅動的分子設計平臺，可對蛋白的結構與功能進行優(yōu)化設計，從而顯著提高蛋白的表達效率與活性；高通量蛋白制備平臺能夠快速支持蛋白的表達和篩選，充分滿足客戶需求；此外，還有獨特的包涵體變復性平臺，有效解決了原核表達蛋白因錯誤折疊而形成包涵體這一痛點問題。

服務優(yōu)勢

服務流程

服務詳情