熒光定量PCR實驗中的常見問題及其解答
熒光實時定量 PCR 技術 (real-time quantitative PCR，qPCR) 幾乎是現代分子生物學技術中最重要、應用最廣泛的核酸定量檢測技術。成功的定量 PCR 實驗離不開精準的實驗設計和操作流程。
實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果。雖然PCR實驗操作簡單，但有時仍避免不了各種各樣的問題。下面整理了關于PCR實驗中幾個常見的問題來進行詳細解答。
01 、沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況，排查是否有以下問題：
1)、循環數不夠（一般不超過45循環，不僅背景值提高，定量也不準）；
2)、PCR程序設置錯誤，檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中；
3)、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；
4)、模板量可能降解或上樣量不足（不超過500ng，根據試劑盒說明書即可），對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發生模板降解，應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復凍融；
5)、引物探針是否合適（尤其是引物跨越內含子，以確保擴增基因組DNA；上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增）。
02、標準曲線不佳
標準曲線線性關系不佳R2<0.9，很有可能是以下環節存在問題：
1)、標準品稀釋或者加樣誤差，使得標準品不呈梯度；
2)、標準品出現降解。應避免標準品反復凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，現配現用；
3)、引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針；
4)、模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以50—500ng為宜。
03、ct值過晚
在相對定量中，Ct值一般控制在15—25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環，否則定量不準確。因此，判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況，需要根據具體實驗設計和目的進行。
1)、 擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進行優化；引物或探針設計不合理，需要重新設計；
2)、PCR程序不合適，改用三步法進行反應，或者優化退火/延伸溫度，可以適當降低退火溫度；退火/延伸時間短（可以在推薦的時間條件下延長10s）；
3)、MgCl2 濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足；
4)、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp；
5)、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
04、熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環節存在問題：
1)、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；
2)、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。
3)、離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果；
05、陰性對照擴增有信號
照擴增有信號排查各操作環節是否有不當，造成交叉污染：
1)、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
2)、引物濃度不佳。適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3)、鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。
4)、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。
5)、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環境進行處理，或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
06、擴增曲線異常
遇到擴增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，有可能是以下環節存在問題：
1)、模板的濃度太高或者降解；
2)、熒光染料的降解；
3)、在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；
4)、液體揮發。耗材氣密性等問題引起液體蒸發，沒有很好的聚集在管子里；
5)、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
07、擴增效率低
該情況適用于針對所有的基因，特別是內參基因仍無法獲得較好的擴增信號時，應考慮如下情況：
1)、反應試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；
2)、反應條件不夠優化。可適當降低退火溫度或改為三步擴增法，適當延長變性退火時間；
3)、反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入的，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系，減少抑制物的影響。
實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果。雖然PCR實驗操作簡單，但有時仍避免不了各種各樣的問題。下面整理了關于PCR實驗中幾個常見的問題來進行詳細解答。
01 、沒有ct值
檢測結果遇到沒有Ct值情況，排查是否有以下問題：
1)、循環數不夠（一般不超過45循環，不僅背景值提高，定量也不準）；
2)、PCR程序設置錯誤，檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集，TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中；
3)、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解；
4)、模板量可能降解或上樣量不足（不超過500ng，根據試劑盒說明書即可），對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；如果發生模板降解，應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復凍融；
5)、引物探針是否合適（尤其是引物跨越內含子，以確保擴增基因組DNA；上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增）。
02、標準曲線不佳
標準曲線線性關系不佳R2<0.9，很有可能是以下環節存在問題：
1)、標準品稀釋或者加樣誤差，使得標準品不呈梯度；
2)、標準品出現降解。應避免標準品反復凍融，將高濃度DNA模板分裝，保存于-20℃或-80℃，現配現用；
3)、引物或探針不佳。重新設計更好更穩定的引物或探針；
4)、模板中存在抑制物。模板濃度過高，根據現有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以50—500ng為宜。
03、ct值過晚
在相對定量中，Ct值一般控制在15—25之間比較好，如果在絕對定量中，對低拷貝數的樣品，Ct值會增大，但是一般不宜超過40循環，否則定量不準確。因此，判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況，需要根據具體實驗設計和目的進行。
1)、 擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適，需要進行優化；引物或探針設計不合理，需要重新設計；
2)、PCR程序不合適，改用三步法進行反應，或者優化退火/延伸溫度，可以適當降低退火溫度；退火/延伸時間短（可以在推薦的時間條件下延長10s）；
3)、MgCl2 濃度不合適，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足；
4)、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp；
5)、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。
04、熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環節存在問題：
1)、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現；引物濃度不佳，尤其是涉及二聚體存在時，適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；
2)、模板有基因組污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。
3)、離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒，不同試劑盒在該方面的優化能力不適合，有些情況下可以通過更換試劑盒改善結果；
05、陰性對照擴增有信號
照擴增有信號排查各操作環節是否有不當，造成交叉污染：
1)、引物設計不夠優化。應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
2)、引物濃度不佳。適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
3)、鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。
4)、模板有基因組的污染。RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異性擴增。
5)、交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染，或操作環境中有氣溶膠造成污染，建議對操作環境進行處理，或者更換新的環境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
06、擴增曲線異常
遇到擴增曲線異常，比如“S”型曲線等等情況，有可能是以下環節存在問題：
1)、模板的濃度太高或者降解；
2)、熒光染料的降解；
3)、在操作熒光定量PCR時，帶上新的一次性手套，蓋上避免任何指紋或者字跡等；
4)、液體揮發。耗材氣密性等問題引起液體蒸發，沒有很好的聚集在管子里；
5)、氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
07、擴增效率低
該情況適用于針對所有的基因，特別是內參基因仍無法獲得較好的擴增信號時，應考慮如下情況：
1)、反應試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解；
2)、反應條件不夠優化。可適當降低退火溫度或改為三步擴增法，適當延長變性退火時間；
3)、反應體系中有PCR反應抑制物。一般是加入模板時所引入的，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系，減少抑制物的影響。
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