當我們用動物活體成像系統來檢測構建的小鼠腫瘤模型是否成功時，通常會遇到一個問題，那就是用GFP報告基因標記的腫瘤細胞在顯微鏡下雖然能檢測到強發光信號，但是一旦注射進體內后，雖然也能檢測到信號，但是背景扣除后就沒有有效信號（圖1），這是為什么呢？

要回答這個問題，我們首先要明白活體成像的成像原理。

小動物活體成像是通過一定的方式對研究對象進行光學標記，使其具有發光的性質，再通過成像技術及設備對光信號進行采集成像。光學標記方式主要采用生物發光與熒光兩種技術。

生物發光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標記細胞或DNA，利用其產生的蛋白酶與相應底物發生生化反應產生生物體內的探針光信號；而熒光成像則是采用熒光報告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進行標記，利用熒光蛋白或染料產生的熒光就可以形成體內的熒光光源。

那么什么情況下選擇生物發光？什么情況下選擇熒光成像？本文將為大家作出解答。

生物發光

生物發光現象在螢火蟲（圖2）、部分水母等物種中較為常見，這是一種自發光現象，無需外源激發光的照射，經研究發現，這種自發光現象是由于特定的酶促反應引起的，比如熒光素酶和底物熒光素之間的化學反應，導致熒光素被氧化而發光（圖3）。
 

圖2                                                                  圖3熒光酶素和熒光素的酶促應

根據這一原理，科學家先通過轉基因技術把熒光素酶報告基因導入腫瘤細胞，接著把腫瘤細胞注射進動物體內，一段時間以后再注射熒光素，由于熒光素容易擴散進入腫瘤細胞，因此會被氧化發光，從而通過檢測光信號就能實現對腫瘤細胞的跟蹤。

在一定范圍內，發光強度與被標記的細胞數量正相關，通過對發光信號的定量，可以反應腫瘤組織的變化情況。活體成像系統依靠高靈敏度的相機，可以捕捉這種微弱的生物發光信號。因為哺乳動物體內不會有熒光素酶報告基因的存在，因此這種檢測方法的優勢是特異性好，無背景信號干擾。缺陷是應用范圍較窄，只能夠用于標記細胞。

熒光成像

當熒光物質被特定波長的激發光照射后會吸收能量轉變為激發態，激發態并不穩定，會發出另一種波長的光來釋放能量，而活體成像系統就是通過捕捉另一種波長的光信號來檢測熒光物質的存在（圖4），并且光信號的強度在一定的范圍內與熒光物質的量成線性關系。

圖4  熒光物質受激發后發光的原理

因此熒光信號的采集需要額外的激發光源，并且在相機鏡頭前還要加裝一塊發射光濾光片。每個熒光通道的組成都包括激發光源+發射光濾光片。

熒光成像的優點是應用范圍廣，不僅可以標記細胞，還可以標記藥物、納米載體等。

缺點主要有以下2個方面：

1、某些熒光物質的發射波長較短，容易被吸收，導致穿透性差，體內成像效果差。比如GFP綠色熒光蛋白的發射光中心波長在510nm左右，容易被血紅蛋白或其他生物組織吸收，導致成像效果差。

2、許多動物組織（例如毛發、腸道、血管等）受激發光照射后，也會發出500-600nm左右的發射光，這就跟GFP、FITC這類熒光物質的發射光接近，造成成像的背景信號較高，信噪比低，不容易區分有效信號和背景信號。常見生物組織的發射光波長信息請見圖5。

圖5  常見生物組織的發射光波長

通常的解決辦法是選擇發射波長較高的熒光物質（發射波長>700nm）進行體內成像，例如DiR、ICG、CY7等。不同發射波長的信號采集效果差異請見圖6。

圖6  不同發射波長信號采集的差異

案例回顧

讓我們回到本文開頭的案例，當我們改用熒光素酶來標記腫瘤細胞后，就能很輕松的采集到發光信號，幾乎沒有背景信號，清晰可見腫瘤細胞的發光部位（圖7），可見選對發光體系的重要性。

圖7

綜上所述，當我們構建小鼠發光模型時，優先選擇構建生物發光模型。如果標記物不是細胞，優先選擇發射波長較高的熒光物質（發射波長>700nm）進行模型構建，比如ICG、CY7等，也可以得到理想的結果（圖8）。

圖8  ICG體內成像（右為對照）

結論

總之，生物發光和熒光技術，如何互為補充，取長補短，分別滿足不同的研究領域，將來的發展方向是兩種技術并重。對于不同的研究，可根據兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法（參考下表）。