胰蛋白酶 (Trypsin) 是一種由胰腺分泌的絲氨酸蛋白酶。它能夠特異性地水解肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基羧基端的肽鍵，將蛋白質分解為較小的多肽或氨基酸，從而參與食物中蛋白質的消化以及體內蛋白質的代謝調節等生理過程。

胰蛋白酶的應用：

細胞培養：

1. 細胞解離：胰蛋白酶能分解細胞間的粘連蛋白，使貼壁生長的細胞從培養容器表面分離，便于細胞傳代和后續實驗操作。

2. 細胞克隆篩選：幫助分離單個細胞，用于克隆培養。

蛋白質研究：

1. 蛋白質測序：通過有限水解蛋白質，產生特定的肽段，為蛋白質的氨基酸序列測定提供幫助。

2. 結構與功能研究：對蛋白質進行特定的切割，有助于研究其結構和功能之間的關系。

制藥領域：

1. 生物藥物生產：參與某些生物制品如胰島素的生產過程，對蛋白質進行修飾和處理。

2. 疫苗制備：處理病原體以獲取有效抗原成分。

食品工業：

1. 肉類嫩化：分解肉類中的蛋白質，改善肉質口感。

2. 臨床診斷：檢測某些疾病狀態下體內蛋白酶的活性變化，輔助疾病診斷。

為什么檢測胰蛋白酶的殘留

藥品質量與安全保障

1. 確保生物制藥產品的純凈度：對于生物制品如單抗藥物、基因治療產品等，微量的胰蛋白酶殘留都可能影響藥物的穩定性和療效，甚至引發嚴重的免疫反應，威脅患者生命安全。

2. 符合嚴格的監管要求：制藥行業受到嚴格監管，檢測胰蛋白酶殘留是保證產品符合質量標準和法規的關鍵環節。

細胞培養與研究的準確性

1. 維持細胞正常生理狀態：在細胞培養實驗中，殘留的胰蛋白酶會破壞細胞間的連接和細胞外基質，影響細胞的生長、分化和功能，導致實驗結果的偏差。

2. 保障細胞實驗的可重復性：精確控制胰蛋白酶殘留量有助于獲得穩定、可靠的實驗數據，促進科學研究的進展。

食品安全

1. 某些特殊食品的生產過程可能使用胰蛋白酶，檢測殘留可以防止其對消費者健康造成潛在危害。

生物技術產業的發展

1. 優化生產工藝：通過監測胰蛋白酶殘留情況，能夠發現生產流程中的問題，從而改進工藝，提高生產效率和產品質量。

2. 增強市場競爭力：產品中胰蛋白酶殘留量的有效控制可以提升企業在市場中的聲譽和競爭力。

胰酶殘留相關法規要求

2020年版《中國藥典》生物制品通則“生物制品生產用原材料及輔料質量控制”中，將非動物來源蛋白水解酶列為中等風險的原材料，將用于細胞消化或蛋白質水解的動物來源的酶列為高風險的原材料；生產用原材料在生物制品中的殘留物可能因其直接的毒性反應、外源因子污染或有害的免疫應答,引發受者產生不良反應或影響產品效力。

《基因治療制品質量控制研究考慮要點》（2023年5月6日發布，點擊下載）中，明確指出“對于風險高的原材料除了評估去除能力外，如需要可在最適工藝階段或終產品中進行殘留量檢測的控制并建立控制標準，作為工藝相關雜質的一部分進行控制，如細胞因 子、生長因子、蛋白酶（如消耗細胞的 重組胰蛋白酶 TrypLE 的殘留控制）、核酸酶（如工藝中普遍使用的降解核酸的核酸酶）、轉染試劑（如 PEI ）、血清及相關溶劑等。

常見胰酶殘留檢測方法

目前，常見的胰酶殘留檢測方法主要包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）、高效液相色譜法（HPLC）和質譜法等。

1. ELISA 法：

原理：基于抗原-抗體特異性結合的原理。試劑盒中包被有抗胰酶的抗體，樣品中的胰酶與抗體結合，再通過與酶標記的二抗反應，最后加入顯色劑，根據顏色深淺定量檢測胰酶殘留量。

優點：

靈敏度較高，能夠檢測到低濃度的胰蛋白酶殘留。

操作相對簡便，易于標準化。

可同時處理多個樣品，適合大規模檢測。

缺點：

可能存在交叉反應，導致假陽性結果。

檢測結果易受樣品基質的干擾。

2. HPLC 法：

原理：

利用物質在固定相和流動相之間的分配差異來分離和檢測化合物。將樣品經過適當處理后注入色譜柱，胰酶依據其化學性質在色譜柱中實現分離，通過檢測器檢測其含量。

優點：

分離效果好，特異性強，能準確測定胰蛋白酶的含量。

重復性高，結果準確可靠。

缺點：

儀器設備昂貴，維護成本高。

樣品前處理復雜，操作技術要求較高

3. 質譜法：

原理：

對胰酶分子進行電離，然后根據離子的質荷比進行分離和檢測，從而確定胰酶的存在和含量。

優點：

具有極高的靈敏度和特異性，能夠檢測極低濃度的胰蛋白酶殘留。

可以同時提供胰蛋白酶的結構信息，有助于更深入的分析

缺點：

儀器昂貴，運行成本高。

對操作人員的技術要求極高。

解決方案

如上所示，常見的胰酶殘留檢測方法都有各自的優劣，雖然在很大程度上能夠提供可靠和準確的檢測結果，但并不能保證絕對的萬無一失。我們可以采取以下措施，盡可能提高胰酶殘留檢測的準確性和可靠性，使其接近“無處遁形”的理想狀態。

1. 多種方法聯合使用：結合不同檢測方法的優勢，相互驗證和補充，降低單一方法的局限性。

2. 嚴格控制實驗條件：包括樣品采集、處理、保存的標準化，實驗人員的專業培訓，儀器設備的定期校準和維護等。

3. 優化檢測試劑盒和方法：不斷改進和研發更靈敏、特異、穩定的檢測試劑和技術。

4. 建立嚴格的質量控制體系：對檢測過程進行全面監控和評估，確保結果的準確性和可重復性。

上海逐典生物自研的新一代Trypelectase重組胰蛋白酶ELISA檢測試劑盒，是針對胰蛋白酶殘留檢測開發的一款高靈敏度的試劑盒，該產品基于雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，定制單克隆抗胰蛋白酶抗體，特異性強，靈敏度高，線性范圍寬廣，批間一致性重復性好，非常適合于工藝開發、過程控制和最終質量控制。

產品特性

1.靈敏度高：檢測限＜50pg/mL

2.線性范圍廣：檢測范圍0.05 - 3.2ng/mL

3.特異性強，重復性好：批內CV＜10%，回收率高

4.適用動物源與非動物源重組豬胰蛋白酶

檢測數據

ELISA試劑盒標準曲線

檢測結果表明：檢測范圍為0.05 - 3.2ng/mL，檢測限<50pg/mL，定量限30pg/ml。

ELISA試劑盒重復性檢測

在高、中、低三個濃度點下，CV%值表現良好，均在10%以下，具有很好的精密度和重復性。

ELISA試劑盒準確性檢測

通過高、中、低三個濃度下，均得到高回收率，回收率區間在80%-120%

 

試劑盒使用常見問題與解決方案

Q: 高背景或陰性對照值偏高

A:

1. 洗板不充分：將洗滌劑注入反應孔充分洗滌，徹底拍干孔中液體

2. 酶結合物過量：檢查酶稀釋度，按說明書標識的稀釋度稀釋

3. 底物污染：加底物前檢查底物是否為透明無色，請勿用變藍的底物，重新用新的底物試驗

4. 陰性對照孔被陽性對照污染：注意洗滌時不要把洗液溢出孔外，不使陰陽對照孔液體連接一起

5. 不同批次試劑混用：檢查試劑批號，請勿用不同批次試劑

Q: 顯色信號弱

A:

1. 試劑過期：檢查試劑盒有效期，請勿用過期試劑

2. 孵育時間過短：按說明書中規定的時間孵育

3. 試劑污染：檢查試劑是否污染，請勿用污染的試劑

4. 酶標儀濾光片不匹配：檢查酶標儀設置及濾光片是否匹配

5. 試劑盒平衡不充分：確保試劑盒試驗前平衡至室溫

6. 顯色時間不夠：增加底物顯色時間

Q: 無顯色信號

A:

1. 檢測抗體、酶、或顯色劑漏加：檢查試驗操作流程，重復試驗

2. 酶被稥氮鈉污染：請使用重新配制的試劑

3. 試劑添加順序有誤：檢查復核試驗添加順順序、流程、重復試驗

Q: 標曲佳但是樣品孔無信號

A:

1. 樣品中靶標物含量低或樣品中無靶標物：設置陽性對照、重復實驗

2. 樣品基質效應影響檢測：重新稀釋樣品后復測

Q: 標曲佳但是樣品信號偏高

A: 樣品中待檢物含量超過標準曲線范圍：重新稀釋樣品后復測

Q: 邊緣效應

A: 孵育溫度不均衡：孵育時每步均使用新的封版膠紙，避免在環境溫度變化大的地方孵育，勿香放反應板

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