人轉移胰腺腺癌細胞吉西他濱耐藥株（ASPC-1/GEM）                             

細胞介紹
一個胰腺癌病人的腹水中的細胞移植到裸鼠后建立了這個細胞株。

細胞特性
1） 來源：ASPC-1耐藥篩選
2） 形態：上皮細胞樣，貼壁生長
3） 含量：>1×10⁶  細胞數             
4） 用途：僅供科研使用

細胞運輸、保存及注意事項

	復蘇細胞	凍存細胞
包裝	充液的T25細胞培養瓶	1mL凍存管
運輸條件	常溫	干冰
保存方式	75%酒精消毒瓶壁，置于37℃恒溫細胞培養箱	-80℃冰箱中保存過夜后轉入液氮/立即復蘇
注意事項	1. 收到細胞請先就培養瓶/凍存管的外觀、細胞的狀態，進行拍照并保存，如有問題請及時聯系我們； 2. 收到的復蘇細胞，若有較多細胞飄起，可能由于運輸導致。請先置于37℃細胞培養箱中靜置2~4h，待細胞貼壁后再做處理； 3. 復蘇細胞充液培養基為不含藥物的維持培養基，收到細胞后請及時更換為完全培養基； 4. 建議收到細胞后，首先進行擴增，并凍存部分細胞以備用。

細胞耐藥誘導過程
待細胞生長穩定后，開始倍增藥物誘導劑量，每個劑量保持至細胞可以穩定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。約10個月后，細胞可在18μg/mL GEM藥物濃度下穩定生長，視為耐藥細胞株構建成功，并命名為ASPC-1/GEM。

細胞培養試劑的配制
1、GEM藥物的配制及保存
建議將GEM藥物配制成18mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解18mg GEM藥物，使其完全溶解。
注意：可根據用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的GEM，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。
2、凍存液的配制
90%優質胎牛血清+10%DMSO，現用現配。
3、完全培養基的配制（推薦使用h005-001b）

成分	體積/濃度
優質胎牛血清	10%
雙抗	1%
GlutaMAX-1谷氨酰胺	1%
GEM	0~18μg/mL
DMEM培養基	補充至所需體積

細胞培養條件
氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養箱濕度為70%~80%。

細胞處理
1）凍存細胞的復蘇
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL完全培養基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL完全培養基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL完全培養基的培養瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養箱中過夜培養。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。
注意：①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養基。須在細胞完全貼壁，形態完全展開，生長狀態穩定后，方可根據實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養基培養至細胞生長狀態較好時，再更換為所需的GEM濃度；
②建議復蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發生爆炸，造成人員傷害。
2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養瓶/皿按照1：2比例傳代）
①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養。
②棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。
③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶-1mL，其它培養器皿可覆蓋培養底面即可），置于37℃培養箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養基中止消化。 
④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。
⑤向細胞沉淀中加入1~2mL完全培養基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養瓶/皿中，添加6~8mL完全培養基，置于37℃恒溫細胞培養箱中培養。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。
注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養基。須在細胞完全貼壁，形態完全展開，生長狀態穩定后，方可根據實驗需要添加GEM藥物。若加藥后細胞生長狀態較為緩慢，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的完全培養基培養至細胞生長狀態較好時，再更換為所需的GEM濃度。
3）細胞凍存
①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×10⁶ ~ 1×10⁷個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。
②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。