2024年2月16日，TIL細(xì)胞藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市，這是基因和細(xì)胞治療領(lǐng)域的重大突破，也是腫瘤免疫治療領(lǐng)域的眾望所歸！
 

近年來(lái)，免疫細(xì)胞療法作為一種新興的治療手段，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。通過(guò)向腫瘤患者輸入具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或激發(fā)集體抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。截至2023年6月，全球生物制藥行業(yè)中有1989種細(xì)胞治療類管線處于臨床前或臨床階段[1]，其中，免疫細(xì)胞的殺傷活性是評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞療法治療效果的一個(gè)重要因素。
 

小分子藥和ADC藥物在體外評(píng)價(jià)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用時(shí)，通常采用經(jīng)典的基于ATP的方法來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的活力 (逐典貨號(hào)CY074F0100KIT)，ATP作為細(xì)胞新陳代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)目呈良好的線性關(guān)系，是細(xì)胞活力檢測(cè)的重要標(biāo)志性分子。免疫細(xì)胞腫瘤殺傷活性的體外評(píng)價(jià)一般會(huì)涉及免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞兩種細(xì)胞，因此不能采取基于ATP的檢測(cè)手段，常用的方法有熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、放射性同位素51Cr釋放檢測(cè)、LDH活性光吸收檢測(cè)和EuTDA細(xì)胞毒法，下面我們來(lái)盤(pán)點(diǎn)這四種檢測(cè)方法的優(yōu)劣勢(shì)，以供大家進(jìn)行選擇。
 

將熒光素酶報(bào)告基因?qū)�入靶�?xì)胞，活的靶細(xì)胞會(huì)表達(dá)熒光素酶，加入熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑 (逐典貨號(hào)CY058F0100KIT) 后釋放出光信號(hào)，活的靶細(xì)胞數(shù)量與釋放出的光信號(hào)成正比，從而可以評(píng)判免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

優(yōu)勢(shì)：

① 靈敏度高, 背景值低。

② 同時(shí)測(cè)定對(duì)多種靶細(xì)胞的殺傷作用。用不同報(bào)告基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系可同時(shí)測(cè)定殺傷效應(yīng), 結(jié)果互不干擾。

③ 機(jī)制研究。用不同的基因調(diào)控元件控制報(bào)告基因的表達(dá)，可進(jìn)一步研究作用機(jī)制。

不足：

周期相對(duì)較長(zhǎng)。建立報(bào)告基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。

圖1. 螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光原理

用放射性51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，在效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的過(guò)程中，靶細(xì)胞由于細(xì)胞膜失去完整性，向培養(yǎng)基中釋放51Cr，培養(yǎng)基中的51Cr與被殺死的靶細(xì)胞數(shù)量成正比，從而評(píng)估免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[2]。

優(yōu)勢(shì)：

測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的金標(biāo)準(zhǔn)。

不足：

① 51Cr放射性對(duì)研究者的健康狀況有一定的影響。

② 對(duì)昂貴設(shè)備和專業(yè)人員的需求能力沒(méi)有得到相對(duì)普及。

圖2. 51Cr釋放測(cè)定原理。該過(guò)程分為3個(gè)主要步驟：51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞裂解釋放51Cr以及檢測(cè)釋放的51Cr

正常情況下，乳酸脫氫酶 (LDH) 存在于活細(xì)胞胞漿內(nèi)，不能透過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，LDH可以透過(guò)細(xì)胞膜釋放到培養(yǎng)基中。釋放出來(lái)的LDH和被殺傷的靶細(xì)胞成正比，利用酶標(biāo)儀讀取OD值，即可評(píng)估殺傷細(xì)胞的活性。

優(yōu)勢(shì)：

① 方法簡(jiǎn)單，可測(cè)的通量比較高。

② 成本相對(duì)比較低。

不足：

① 如果效應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)不好，會(huì)出現(xiàn)數(shù)據(jù)重復(fù)性不好、結(jié)果不穩(wěn)定的情況。效應(yīng)細(xì)胞狀態(tài)與個(gè)體間的差異及凍存復(fù)蘇等均有關(guān)。

② LDH可能存在部分自發(fā)釋放現(xiàn)象，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

EuTDA的檢測(cè)原理與51Cr測(cè)定法相似，乙酰酯化的BATDA能迅速進(jìn)入靶細(xì)胞，并在水解作用下形成TDA留在靶細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞受到損傷后釋放到胞外的TDA與熒光探針Eu3+ 形成Eu-TDA 復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)Eu-TDA 的時(shí)間分辨熒光信號(hào)，來(lái)評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異殺傷活性。

優(yōu)勢(shì)：

靈敏度高、安全性好，對(duì)于非特異性死亡的干擾較小。
 

逐典生物螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒旨在準(zhǔn)確、靈敏、高效地測(cè)定螢火蟲(chóng)螢光素酶活性，針對(duì)報(bào)告基因檢測(cè)不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測(cè)系統(tǒng)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.檢測(cè)靈敏度高，信號(hào)穩(wěn)定性好

HEK293-NFκB-LUC細(xì)胞加入梯度稀釋的TNFα 在37°C、5% CO2條件下刺激6小時(shí)后，分別用增強(qiáng)型、超敏型、穩(wěn)定型檢測(cè)試劑進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

2.操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測(cè)緩沖液混合后直接加入到細(xì)胞即可。

3.穩(wěn)定性好

同時(shí)在10次反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)中，逐典全系列報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒顯示出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)

【1】http://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.11.001

【2】Kiesgen S, Messinger JC, Chintala NK, et al. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 2021 Mar;16(3):1331-1342. doi: 10.1038/s41596-020-00467-0.