聚合酶鏈反應(PCR) 技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。PCR結果不滿意時，首先要冷靜分析可能的原因，并參考以下建議進行優化，以期獲得更準確的實驗結果。

1. 樣本質量與處理：確保采集的樣本具有代表性，避免污染和交叉污染。樣本的保存和處理要嚴格按照標準操作程序進行，以保證樣本中的核酸完整性和穩定性。

2. 引物設計：引物的特異性和退火溫度對PCR結果至關重要。引物設計時應充分考慮目標序列的特異性，避免引物之間的互補和非特異性結合。

3.PCR條件優化：針對不同的模板和引物，優化PCR的反應條件，如退火溫度、延伸時間等。同時，選擇合適的PCR酶和緩沖液體系，以提高擴增效率。

4. 抑制劑和污染物的排除：抑制劑和污染物可能影響PCR的擴增效果。因此，在PCR反應前，應對樣本進行預處理，以去除可能的抑制劑和污染物。

5. 重復實驗與驗證：當PCR結果不滿意時，建議重復實驗以驗證結果的可靠性。同時，可以采用其他方法如測序、實時定量PCR等對結果進行驗證。

6. 記錄與分析：詳細記錄每次PCR實驗的條件和結果，分析可能導致結果不滿意的因素，并據此進行調整和優化。

參考建議：

1、將PCR反應的試管與反應板緊貼。

2、當酶反應混合物以70℃“熱啟動”開始循環時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。

3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統的因素，必須與其它成份保持平衡。

4、對于有問題的PCR反應，例如模板的量少，模板不純和環狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預變性，后加模板進行正常PCR擴增。

5、沒有擴增產物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。

6、泳道中出現模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應中可能缺少游離的Mg2+。

7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。

8、檢查模板和引物的用量。

9、增加循環次數和/或模板DNA的用量。

10、泳道中出現模糊條帶： 減少循環次數或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設計引物或設計更長的引物。

11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數反應中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數情況下可以得到滿意的結果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結果，優化Mg2+的濃度是必需的。

12、基因組DNA模板的質量顯著影響PCR反應。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統的基因組DNA能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關文獻。降低二級結構和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應的退火溫度來增加反應的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優先擴增的影響。

13、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應該盡可能的降低變性溫度。

14、延伸：68--72℃下進行延伸操作。循環延伸：盡量采用循環延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產物補平后再進行。測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產生均一的（染色體）帶型。

15、引物設計： 一般長度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結構； 引物對的Tm值應該接近。

經DEPC處理好的東西如EP管,剪刀等接下來該怎么辦？是用雙蒸水沖洗,還是用DEPC處理的水沖洗？

溫馨提示：

經DEPC處理好的EP管,應該去高壓，既滅菌又去除了DEPC，DEPC再沒高壓的情況下是有毒性的。剪刀等浸泡后用DEPC處理的水沖洗。

處理過程應該是這樣的：在ddH2O中加入0.1％的DEPC，用攪拌子攪拌2小時，使DEPC充分溶解在水里。然后將EP管,tip頭及大離心管etc浸入以上水中，后放入37度培養箱中過夜，第二天倒掉液體后高壓。（不是僅僅DEPC處理的水沖洗就可以的）。DEPC處理的水不重復使用。

經DEPC處理好的東西如EP管,應先在70-80度烤干后，再高壓剪刀玻璃制品可以用DEPC處理后180-200度干烤2小時。

通過以上建議的實施，我們可以逐步排除可能導致PCR結果不滿意的因素，提高實驗的準確性和可靠性。同時，不斷總結經驗教訓，優化實驗流程，為未來的研究奠定堅實基礎。