使用細胞器選擇性染色劑或染料讓細胞器顯色是細胞和組織熒光成像的關鍵。這些特異性染色劑適合用作抗體復染劑，幫助識別細胞內特定位置的目標靶點。除了固定細胞的研究外，對活細胞的研究可以更好的了解細胞內生命活動的狀態及其變化，其難點在于活細胞細胞膜的選擇透過性，會阻止外界物質的進出，因此選擇合適的熒光染料至關重要。
 

本文主要針對以下幾個常見的亞細胞架構：細胞骨架、線粒體、內質網、高爾基體、細胞核、溶酶體、細胞膜，為大家介紹如何在活細胞或固定細胞中選擇合適的試劑/探針分別對它們進行染色。

 

一、細胞骨架

1.1 肌動蛋白

1.1（a）活細胞肌動蛋白染色：

對于活細胞中的肌動蛋白染色，可以通過帶有熒光染料的肌動蛋白，或帶有GFP標記的肌動蛋白來進行染色。雖然熒光肌動蛋白能夠最準確的定位出靶點肌動蛋白的結構，但對于某些細胞（如原代細胞），通過顯微注射或蛋白質轉染試劑的手段，較難實現將熒光肌動蛋白引入目標細胞中。此時最好的方式是使用低細胞毒性、高特異性、可通過活細胞的細胞呈象探針（SIR-actin™）
 

《Natural Method》中，就描述了如何利用這種探針來進行細胞骨架結構的活細胞呈象，如圖2所示。同時，其中還就染色探針在長期成像濃度下對細胞的毒性進行了研究，結果表明在24小時內，SiR -tubulin和SiR -actin對原代人成纖維細胞都沒有表現出明顯的細胞毒性。
 

圖1. 結構化照明顯微鏡(Structured illumination microscopy，SIM)下，使用SIR -tubulin(左)或SIR -actin(右)染色的人成纖維細胞。

 

圖2. 對SiR-tubulin（上）和SiR-actin（下）熒光染色探針毒性測試結果。白色亮點代表代表沒辦法繼續進行有絲分裂或由于細胞骨架的改變無法在表面繼續生長的細胞。

 

1.1（b）固定細胞肌動蛋白染色：

最常見的固定細胞中肌動蛋白染色劑是鬼筆環肽偶聯物（phalloidins）。帶正電或負電的熒光染料會通過非特異性的離子相互作用與其他蛋白質結合，導致產生更高的背景；Actin-stain系列的鬼筆環肽熒光探針是非離子型的，因此更有助于獲得理想的低背景結果。
 

圖3. 在Swiss3TS細胞中，使用 anti-vinculin（紅色）進行，Dapi進行核染(藍色)，用Actin -stain™488 Phalloidin (# PHDG1, Cytoskeleton對F-actin進行染色(綠色)

 

 

若實驗中使用到甲醛進行固定或透化，甲醛會破壞鬼筆環肽的天然結構，因此可以考慮使用免疫熒光法對固定細胞中的肌動蛋白進行染色。如今被發現的肌動蛋白亞型總共有6種，包括α-actin （ACTA1）、平滑肌α-actin（ACTA2）、細胞質β-actin（ACTB）、心肌α-actin（ACTC1）、細胞質γ-actin（ACTG1）、平滑肌γ-actin（ACTG2/ACTA3）。針對不同亞型的肌動蛋白，可以選擇不同的特異性一抗。
 

1.2 微管蛋白

微管蛋白（Tubulin）的染色和肌動蛋白類似，固定細胞中可以使用鬼筆環肽和免疫熒光法；活細胞中則可以使用特殊的熒光探針進行顯色。

 

二、細胞核

對細胞核進行染色主要是利用能與DNA相結合的染料或探針，活細胞的細胞核熒光探針，如SiR™、SPY™、Hoechst™等；固定細胞的細胞核染料：DAPI和溴化乙錠（EB）。

 

2.1 活細胞中細胞核的染色
 

圖4. 使用SPY™505-DNA（綠色）和SPY555-actin（洋紅色）對Hela活細胞進行復染。

 

2.2 固定細胞中細胞核的染色

固定細胞還可以使用免疫熒光法對細胞和進行染色定位，此時可以精確的定位到核膜和核仁，如圖5(綠色熒光)所示：

 

圖5. 免疫熒光法分別對核膜(A) / 細胞核(B) /核仁 (C) / 細胞核(剔除核仁) (D)進行染色（綠色熒光）。

 

圖5中使用的相關抗體：

貨號	產品	染色部位	抗體靶標基因
AMAb91251	Monoclonal Anti-LMNB1 Antibody	Nuclear membrane	Lamin b1
AMAb90959	Monoclonal Anti-PARP1 Antibody	Nucleus	poly (ADP-ribose) polymerase 1
AMAb90961	Monoclonal Anti-NIFK Antibody	Nucleoli	Nucleolar protein interacting with the fha domain of mki67
AMAb90549	Monoclonal Anti-FUS Antibody	Nuclear (without nucleoli)	fused in sarcoma

 

三、線粒體

線粒體是細胞中重要的功能器官，使用特定的熒光染料或探針對其進行染色，可作為細胞是否健康的重要指標之一。染料在線粒體上的積累和定位取決于線粒體膜電位，在有線粒體膜電位的健康細胞中，會顯示明亮的熒光信號，而在失去線粒體膜電位的細胞中，則熒光信號弱。

 

3.1 活細胞中線粒體染色

為了在活細胞中對線粒體標記，也需要借助專門的熒光探針試劑。細胞將在一定濃度的特定探針中培養，接著探針通過被動擴散穿過細胞膜并在活性線粒體中積累。一旦線粒體被探針標記，細胞就可以用醛基固定劑進行處理，以便對樣本進一步處理。因為MitoTracker® Red CMXRos和MitoTracker® Deep Red FM探針產生的熒光波長更長，因此適用于多重染色標記實驗中。

 

部分相關染料推薦：

貨號	產品	Abs (nm)	Em (nm)	活/固定細胞
9074	MitoTracker®Green FM	490	516	活細胞
2252	LumiTracker® Mito Orange CMTMRos	551	576	活細胞
9082	MitoTracker® Red CMXRos	579	599	活細胞
3170	LumiTracker® Mito Red FM	581	644	活細胞
8778	MitoTracker® Deep Red FM	644	665	活細胞

 

3.2 固定細胞中線粒體染色

在固定細胞中，有許多可用的線粒體標志物，常見的線粒體標志物如表1所示

蛋白名稱	基因名稱	Uniprot ID
Apoptosis-inducing factor 1 , mitochondrial	AIFM1	O95831
Cytochrome c oxidase subunit 4 isoform 1, mitochondrial	COX4I1	P13073
Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial	CPS1	P31327
FAST kinase domain-containing protein 2, mitochondrial	FASTKD2	Q9NYY8
Hexokinase-1	HK1	P19367
Heat shock 70 kDa protein 1A	HSPA1A	PODMV8
60 kDa heat shock protein, mitochondrial	HSPD1	P10809
Mitochondrial dynamics protein MID51	MIEF1	Q9NQG6
Cytochrome c oxidase subunit 1	MT-CO1	P00395
NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 7, mitochondrial	NDUFS7	O75251
Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM16	PAM16	Q9Y3D7
Prohibitin	PHB	P35232
Superoxide dismutase [Cu-Zn]	sOD1	P00441
Mitochondrial import receptor subunit TOM22 homolog	TOMM22	Q9NS69
Elongation factor Tu, mitochondrial	TUFM	P49411
Mitochondrial brown fat uncoupling protein 1	UCP1	P25874
Mitochondrial uncoupling protein 2	UCP2	P55851
Mitochondrial uncoupling protein 3	UCP3	P55916
Voltage-dependent anion-selective channel protein	VDAC1	P21796

表1. 常見的線粒體標志物。

 

四、溶酶體

溶酶體是動物細胞中重要的細胞器，內部含有豐富的水解酶，其結構的完整性與生命體的生理病理均有著密切的關系。
 

4.1 活細胞溶酶體染色

常見的針對活細胞中溶酶體的熒光探針包括LysoTracker™系列，由于其對酸性細胞器有高度選擇性（溶酶體內部pH約3.5~5），因此可以對溶酶體進行特異性染色。
 

相比LysoTracker™，LysoBrite™的探針在長時間追蹤活細胞中的溶酶體上，具有更明顯的優勢。LysoBrite™染料可以在活細胞中停留超過一周，細胞毒性極小，而LysoTracker染料只能使用幾個小時。且LysoBrite™染料比LysoTracker染料更具有光穩定性，如圖6所示。

 

圖6.A: LysoBrite™ Red染色, B: LysoTracker™ Red (來自Invitrogen)進行染色的Hela細胞圖像。用Olympus熒光顯微鏡對0秒和120秒曝光時間下的信號進行比較

 

Name	Excitation (nm)	Emission (nm)
LysoBrite™ Blue	434	480
LysoBrite™ Green	501	510
LysoBrite™ Red	576	596
LysoBrite™ Deep Red	597	619
LysoBrite™ NIR	636	651

表2. LysoBrite™系列探針的激發/吸收波長對比表

 

五、內質網和高爾基體

內質網(ER)和高爾基體主要負責細胞內脂質和蛋白質的分類，因此，針對這兩個細胞器的大部分染色探針都是脂質或是可以影響蛋白質運動的化學物質。在活細胞和固定細胞中，ER和高爾基體的扁平膜囊可以用各種親脂探針進行染色，然后根據其形態進行區分。

5.1 活細胞中ER和高爾基體的染色

ER-Tracker™ 系列的染色探針針對的是活細胞，對ER具有高度選擇性。這些染料很少染色線粒體，不像傳統的ER染色劑DiOC6(3) (D273)，ER-Tracker™ 探針的對細胞毒性很小。當使用特定優化方案對細胞進行染色時，即使經過甲醛的處理，染色模式仍然保留。

還有一類熒光鞘脂衍生物（sphingosine derivative），如NBD C6-ceramide、BDP FL-ceramide等，也是ER/高爾基體在活細胞中的重要染色探針之一。

 

六、細胞膜

細胞脂膜是動態的、流體結構(約4納米厚)，這是生物學上的必要條件，因為若要細胞參與基本的細胞和亞細胞生理功能（如遷移、細胞擴散、吞噬、細胞分裂、內吞、機械轉導和代謝等），則需要這些細胞膜/基質膜能夠改變形狀和張力。
 

6.1 活細胞中細胞膜染色

對細胞膜張力的研究在細胞生理學中很重要。熒光膜張力探針Flipper-TR®(Spirochrome, Ltd.)可以對活細胞中的膜結構進行特異性染色，以對膜的張力進行研究。如圖6所示，對經歷了高滲透沖擊的細胞的細胞膜結構進行可視化分析。
 

圖7. 使用Flipper-TR®探針對細胞進行染色。在高滲透沖擊前(上)和沖擊后(下)染色的Flipper-TR®圖像。灰度表示熒光強度，彩色編碼表示熒光壽命。右邊的直方圖顯示了滲透沖擊后的壽命變化。

 

除此之外Flipper-TR®探針還提供針對其他細胞器膜/基質膜（Plasma membrane）的染色，如溶酶體膜、線粒體膜、內質網膜。