細胞培養實驗室方法及流程
內容大綱
細胞培養與廢液抽吸
細胞培養流程
廢液抽吸方法的比較法
細胞培養實驗室基礎設備
廢液處理與廢棄辦法
廢液抽吸 (aspiration / suction) 為現代生物學技術中常用的技術，用以移除廢棄液體。生物學中常見的細胞培養，是將真核或原核細胞培養于適宜的培養液 (culture medium) 及環境中，使其在受控制的狀態下生長 (growth) 及增殖 (proliferation)的過程。 細胞培養的流程包含解凍細胞、培養 (cell culture)、繼代培養 (俗稱分盤，cell subculture) 及冷凍細胞等步驟。
然而，細胞生長過程中會產生代謝物、細胞碎片等廢棄物影響細胞健康，甚至導致細胞凋亡 。因此在細胞培養過程中，需定期更換培養液，而移除舊有培養液、洗滌液的行為，則為廢液抽吸。
真空廢液抽吸裝置 (suction system, aspiration system) 常見如上圖，主要包含：
A. 真空瓶 (vacuum flask)
B. 緩沖瓶 (safety bottle)
C. 過濾器 (filter)
D. 真空源 (vacuum source)
連接并啟動真空源后，細胞培養瓶/皿中的廢液會因壓力差而被抽吸、收集至真空瓶，緩沖瓶則做為防溢裝置使用，以避免廢液被抽吸至真空源內。過濾器可使用HEPA濾膜(High Efficiency Particulate Air filter 或 0.22 µm過濾器，以過濾掉廢液及空氣中的粒子、確保抽吸效率。
細胞培養流程細胞培養前，請確認操作環境符合無菌操作條件，且應避免和細菌實驗共享設備，以防污染。
1. 解凍細胞 (thawing cells)：將冷凍細胞以 37 oC 快速解凍、回溫，以避免細胞損傷。
2. 培養 (cell culture)：依據細胞種類和濃度，將細胞和培養基均勻混合后，放入培養箱中培養。
3. 繼代培養 (cell subculture)：當細胞生長至一定程度后，收集細胞，分殖于新的培養基中。
進行繼代培養時，其依細胞種類不同，處理方式可分為以下兩大類：
a. 附著型細胞 (adherent cell)，又稱貼壁培養、單層培養 (monolayer culture)
· 去除舊培養基廢液
· 以 Phosphate buffered saline (PBS) 洗滌細胞一至二次
· 加入 trypsin-EDTA溶液，于 37 oC 下作用 2~20 分鐘，使細胞可自培養瓶/皿中脫落
· 加入含有血清的新鮮培養基中，以終止胰蛋白酶作用
· 將脫落的細胞及其團塊打散、混合均勻后，收集所有液體
· 離心后移除上清液，并添加新鮮培養基，依稀釋比例轉移至新的培養瓶/皿中進行培養
b. 懸浮型細胞 (suspension cell)，又稱懸浮培養 (suspension culture)
· 將細胞培養液以 1000 rpm 離心 5 分鐘后，吸除上清液
· 加入適量新鮮培養基，與沉淀細胞混合均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養瓶/皿中進行培養。
4. 冷凍細胞 (cryopreservation)：獲得目標細胞株后，將細胞懸浮于含有 5~10 % DMSO (二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide) 及 30~50% FBS (胎牛血清，Fetal Bovine Serum) 的新鮮培養液中，以 -80 oC 或液態氮等低溫設備保存。
5. 細胞計數 (cell counting)：用以計算細胞濃度，可利用傳統血球計數器 (Neubauer chamber) 或自動計數器 ，計算細胞濃度可用來判斷目前細胞生長的情況。
廢液抽吸方法的比較廢液抽吸目前有多種方法可以進行。 早期實驗室多利用移液器(pipette)或電動吸管抽吸廢液，然而因為需要重覆抽吸及排除液體，長時間使用下來易造成手部不適及疲勞。除此之外，電動吸管須搭配無菌刻度吸管使用，而現多使用拋棄式吸管排除污染疑慮，因此一次實驗下來通常會產生大量廢棄物，造成環境負擔。
現代實驗室則普遍會自行購置真空幫浦搭配真空瓶自行組裝，如此會較電動吸管有效率，且設備取得較容易，然而自組式系統常見許多例如：管線配置不良，造成工作環境混亂、或是玻璃吸管經常破裂等安全性上的缺點。
Lafil 廢液抽吸系統及 BioDolphin 廢液抽吸套件主要為生命科學細胞培養或實驗過程中溶液抽吸應用，可直接放置于無菌無塵操作臺 (laminar flow) 使用。Lafil 廢液抽吸系統整合真空源、真空瓶與廢液抽吸套件，提供實驗室一體化解決方案，更比傳統廢液抽吸系統減少一半臺面占用面積，并使用圍籬式平臺固定真空瓶，避免操作者不小心碰觸瓶身而傾倒。
洛科Lafil 廢液抽吸系統及 BioDolphin 廢液抽吸套件
| 實驗室電動吸管 | 自組真空抽吸系統 | 洛科廢液抽吸系統 | |
| 整合式設計 | 是，單一產品 | 否 | 是，一體化all-in-one設計 |
| 抽吸耗材 | 無菌刻度吸管 | 吸管尖 (tip | 吸管尖 (tip |
| 長時間操作 | 易造成手部肌肉疲勞 | 易造成手部肌肉疲勞 | 符合人體工學、單手退tip設計 |
| 吸力調節 | 無 | 有 |
Lafi100 無 Lafil200 有 |
| 廢液清除 | 每次抽吸排凈 | 吸取至真空瓶滿后清除 | 吸取至真空瓶滿后清除 |
| 真空瓶 | 無 | 通常為 1 L 抽氣瓶 |
Laifl100 ：1L Lafil200：4L PP材質或玻璃 |
| 幫浦/設備保護 | 無 | 無 | 有 |
| 廢液溢漏危險 | 無 | 高風險 | 無 |
| 置入無菌操作臺 | 可 | 不可 |
Laif100：可 Lafil200：不可 |
| 空間利用性 | 體積小 | 管路雜亂占空間 | 可省去自組系統50~65%空間 |
| 環境友善 | 易產生大量拋棄式廢棄物 | 易產生大量拋棄式廢棄物 | 所有配件采用耐高溫高壓滅菌材質，另有節能安靜的eco機種 |
| 特殊需求 | 無 | 無 |
Lafi200：可同時雙人操作l |
細胞培養實驗室基礎設備
| 無菌操作臺，或生物安全柜 Laminar Flow Hood Biological Safety Cabinet, BSC (Class II) |
無菌操作臺可作為實驗室內的無菌工作區，同時也可遏止各種于微生物實驗程序中可能產生的傳染性飛濺物或氣膠。 |
| 培養箱 Incubator |
使用培養箱的目的是為細胞生長提供舒適的環境。培養箱可透過控制溫度、濕度和二氧化碳濃度提供細胞適合的生長條件。 |
| 廢液抽吸系統 Suction System (Aspiration System) |
使用廢液抽吸系統，可以更輕松地從細胞培養容器中吸除培養基和試劑。 |
| 光學顯微鏡 Optical Microscope |
光學顯微鏡是細胞培養bu可或缺的工具，如正立顯微鏡、倒立顯微鏡。其將細胞可視化，以監測細胞生長情形、細胞形態、計數與識別污染物質。 |
| 低溫儲存設備 Cryogenic Storage |
隨著傳代次數的增加，連續培養的細胞可能會出現遺傳不穩定性，如遺傳漂變、哀老； 因此將它們保存在低溫儲存設備中以供長期儲存是細胞培養中重要的步驟。 |
| 水浴器 Water Bath |
細胞實驗室普遍會將水浴槽設置為37 oC，用于預熱培養基以及解凍冷凍細胞或試劑等。 |
廢液處理與廢棄辦法
含有危險化學品（如氯）之有機廢液應收集至設有適當標示之專用廢液桶，不含危險化學品之其它廢液可一并收集于一般混合廢液桶，廢油則需收集于廢油桶中。細胞培養用的廢液應加入適當濃度的消毒劑，如漂白水(次氯酸鈉Sodium Hypochlorite)，使細胞致死，再倒入水槽或廢液桶。培養皿等生物醫療相關廢棄物則應置于生物醫療廢棄物袋中，進行高溫高壓滅菌后以一般廢棄物丟棄，或是請依照我國生物醫療廢棄物相關規定處理。
