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選擇性清除內(nèi)毒素的最佳吸附條件介紹

瀏覽次數(shù):631 發(fā)布日期:2023-9-15  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
圖35-3顯示了從蛋白質(zhì)溶液中吸附內(nèi)毒素的原理。陰離子交換配體和一切內(nèi)毒素選擇性配體在工作條件下帶正電荷網(wǎng),如此,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素在低離子力時被吸附,此時蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素幾乎不能回復(fù)。當(dāng)吸附能力耗盡之后(不取決于是否系內(nèi)毒素特異性),蛋白質(zhì)的回復(fù)便可接近100%。所采用配體的結(jié)合位點的多少對蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素來講是一樣多的,所以蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素對這些結(jié)合位點的競爭影響了內(nèi)毒素的清除。同樣,對于一些已經(jīng)被吸附的內(nèi)毒素來說,在蛋白質(zhì)濃度比內(nèi)毒素濃度高出6個數(shù)量級的情況下也是可以被取代下來的。
 

選擇性清除內(nèi)毒素的最佳吸附條件


另一方面,內(nèi)毒素和帶陽離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以致親和配體和蛋白質(zhì)競爭內(nèi)毒素,如果在吸附劑表面的電荷密度高或者使用一種選擇配體,使得平衡傾向于吸附劑,則可使內(nèi)毒素得到去除。當(dāng)帶陽離子電荷網(wǎng)的蛋白質(zhì)從陰離子交換劑上解脫時,能得到幾乎100%的蛋白質(zhì)。

迄今為止,以上所提及的吸附劑沒有一個已被實際用于蛋白質(zhì)溶液的內(nèi)毒素清除。但是,離子力起到了重要的作用,特別是在吸附過程的最初階段。低離子力的物質(zhì),相當(dāng)于小于50mmol/L的NaCl,常被推薦用作離子交換劑。具有較高離子力的物質(zhì)如多黏菌素B和DAH,在被用作親和吸附劑時,與配體的結(jié)合主要依靠離子間作用力和疏水作用。在合適的條件下,其關(guān)系常數(shù)超過109。多陽離子配體較少依靠離子力。蛋白質(zhì)的去污染與其在環(huán)境條件下的等電點及pH值穩(wěn)定性有很大的關(guān)系。一般來說,當(dāng)pH值接近蛋白質(zhì)的等電點時,內(nèi)毒素能最大限度地被去除。強(qiáng)堿或強(qiáng)酸性蛋白質(zhì)的化學(xué)特性使其在純化時發(fā)生不可逆的丟失,而且沉淀反應(yīng)也是一個問題,所以必須尋找一個折中的辦法。對于酸性蛋白質(zhì)而言,環(huán)境pH值應(yīng)該盡可能接近PI,同時應(yīng)該采用多聚的或疏水性弱的配體。等電點接近7的蛋白質(zhì)應(yīng)該在pH≈PI的環(huán)境下進(jìn)行去污染。雖然用內(nèi)毒素選擇性配體能得到更好的結(jié)果,但陰離子交換劑也可以采用。離子交換劑對堿性蛋白質(zhì)的去污染結(jié)果也相當(dāng)不錯,特別是帶有4條氨基酸基團(tuán)的配體,它在堿性條件下能顯示出較高的離子密度,并在提高pH值后與內(nèi)毒素的吸附相當(dāng)匹配。
 

選擇性清除內(nèi)毒素的最佳吸附條件

應(yīng)該注意到,不僅僅是帶凈電荷的蛋白質(zhì),也包括所有陽離子配體,其電荷密度隨著pH值的改變會發(fā)生變化,但除外那些有4條氨基酸的配體。pH值的升高可導(dǎo)致電荷密度的減少,具體數(shù)值可因配體的pK或pI而有差別。

如果內(nèi)毒素和帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)之間的作用是由Ca2+介導(dǎo)的,則應(yīng)該輔以1~5mol/L的EDTA。EDTA是一種強(qiáng)螯合劑,可使蛋白質(zhì)-Ca2+-內(nèi)毒素復(fù)合物的平衡傾向于解離,由此增進(jìn)吸附劑的去污效果.此外,如果要采用輔以3-吡喃氨基葡萄糖或其他不帶電荷的去污劑,則應(yīng)事先篩選,因為在應(yīng)用這些物質(zhì)時會帶來其他問題。

評價層析柱在耗盡其蛋白質(zhì)結(jié)合能力之后留在柱里面的內(nèi)毒素的量是十分必要的,這在部分吸附時也是一樣的道理,即蛋白質(zhì)或內(nèi)毒素濃度的變化會同時影響到清除效率和蛋白質(zhì)的回收。

發(fā)布者:科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技(北京)有限公司
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