選擇性清除內(nèi)毒素的方法之雙相抽提法的介紹
通過添加去污劑，可干擾蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素之間的相互作用，使層析的效果得以提高。同樣，去污劑也能用于雙相抽提法，內(nèi)毒素可通過脂質(zhì)A的堿性鏈與去污劑發(fā)生非極性作用而從水相中分離出來。三硝基甲苯系列的去污劑在水溶液中具有一種融合性空隙，在某一稱為“云點（cloud point）”的關(guān)鍵熔度時，微團聚合成含水量少的小滴從而形成一種新的相態(tài)。內(nèi)毒素被保留在富含去污劑的那一相里。之后通過離心或加熱，這兩相分離，富去污劑層在底部。如果有必要的話，這個過程可以一直重復(fù)，直至內(nèi)毒素濃度達到下限值以下。三硝基甲苯X-114的云點是22℃，這在純化蛋白質(zhì)時是有利的。含內(nèi)毒素的蛋白質(zhì)溶液一般冷藏于4℃的溫度下，實現(xiàn)兩相分離時的溫度大于22℃。三硝基甲苯X-110的云點是75℃，這對大多數(shù)蛋白質(zhì)是不適合的。
用其他技術(shù)從克雷伯桿菌I-714中分離內(nèi)毒素和外毒素比用兩相清除法更為困難。Adam等采用三硝基甲苯X-114進行兩相分離前后內(nèi)毒素濃度相差100倍，最終的內(nèi)毒素量為30EU/mg，脂多糖的生物活性丟失50%。Cotton等的結(jié)果與此相似，大約100倍的內(nèi)毒素從質(zhì)粒DNA中被清除，最終的內(nèi)毒素含量是0.1EU/6ug DNA。此外，他們采用多黏菌素B作為吸附劑取得更好的效果。Liu等也使用三硝基甲苯X-114雙相抽提法（圖35-1）和親和吸附劑對重組蛋白質(zhì)如心肌鈣蛋白Ⅰ肌紅蛋白和肌酸激酶同工酶的去內(nèi)毒素污染進行了驗證。他們得出結(jié)論，相分離是最有效的方法，可以清除內(nèi)毒素達98%~99%，最終的殘留量為2.5～25EU/mg不等，具體因蛋白質(zhì)的不同而異。
由于總有一定量的去污劑殘留在蛋白質(zhì)溶液中，這就需要用吸附活凝膠滲透層析法將其去除，而這又造成了10%～20%的產(chǎn)物丟失，且由于總要重復(fù)多次而費時費力。溫度的波動使得一次進行大規(guī)模的操作有困難，而且這樣又限制了那些生物多聚體分割成水相，特別是對于疏水的蛋白質(zhì)和DNA來說。
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內(nèi)毒素
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