隨著多重熒光免疫組化技術的不斷發展，越來越多老師希望在自己的片子上看到更豐富的靶標信息，意味著我們需要用到更多種熒光染料去完成染色，但由于熒光染料產生的信號不是單純的線性，而是呈現山峰狀的分布，在最高點信號固然最好，但在最高點左右的一段范圍內都能夠捕獲到它的信號，那么相鄰的染料之間，難免會有信號的重疊，導致最后的結果無法被準確判讀。

不同熒光染料光譜示意圖

mIHC結果出現信號重疊，一般表現為兩種情況：

1、信號完全重疊，沒有各自獨立信號存在（理論上指標間不存在共定位）

圖1：左：merge；中：CD4；右：CD8

2、有各自獨立的陽性信號，但大部分信號高度重疊（理論上共定位信號沒有那么多）

圖2：左：merge；中：CD3；右：CD8

圖3：紅箭頭：共定位信號；白箭頭：CD8信號

可能原因：選用波長十分相近的熒光染料進行了染色；前一輪染色的抗體沒有洗滌干凈

解決方案：

1、在選擇熒光染料的時候，選擇相距波長較遠的熒光染料，以Absin的多色試劑盒為例，選擇四色（TSA520、TSA570、TSA650、DAPI）、五色（TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI）和七色plus（TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI），這幾個試劑盒里的染料之間是幾乎不會有串擾的情況。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的熒光波長挨得十分接近，TSA650和TSA620挨得很近，在做染料選擇的時候就要避開同時應用，比如已經用了TSA520，那在同一個項目中就不要用TSA540再進行染色；如果無法避免必須要同時用，就需要掃描儀或者顯微鏡具有光譜拆分的功能，完成掃描以后再在工作站進行通道的拆分優化，但至于拆分的效果也取決于染色和成像的效果，所以為了得到一個不錯的結果，可能需要實驗者不斷地調試與優化實驗的條件。

2、如果所使用的染料之間本身間隔較遠，不存在光譜重疊度過高的情況，那出現這種信號的高度重疊，多半是因為前一輪抗體沒有洗脫干凈，且前一輪的一抗來源恰好跟后一輪相同，當前一輪沒有洗干凈的時候，殘留的一抗也會跟后一輪的二抗結合，導致信號出現重疊。需要優化洗脫的條件。修復液+高壓的條件基本都能洗脫得比較干凈，但因為條件較強，很容易出現組織從片子上脫落的情況；如果是選擇修復液+微波加熱的方式，那就需要優化微波修復的條件，Absin實驗室推薦可以采用先高火煮沸修復液，取出修復盒后快速插入待洗脫/修復的切片，蓋蓋子后繼續放入微波爐低火維持15min，如果最后洗脫效果不理想，可以延長低火維持的時間，或者調整微波爐的功率，不同微波爐的火力和功率有區別，需要根據具體的實驗結果進行更改；如果是選用Absin抗體洗脫液（abs994），則需要關注沒洗干凈的指標是否是一些較難洗脫的蛋白，如結構蛋白、細胞骨架蛋白、胞漿胞核蛋白，考慮需要延長洗脫的時間或更換更強的洗脫方式（如熱修復），或者將難以洗干凈的蛋白放到最后順位去染色。

3、當兩通道各自存在獨立信號，但出現大量非特異性共定位重疊信號：

① 如圖3所示，真正的共定位信號兩指標熒光都很強，而非特異性的共定位信號一個指標很強，另一個指標很弱，較容易區分，在不調整實驗的情況下，可以通過調整儀器的曝光時間來改善（如圖中在CD8通道出現了比較弱的CD3信號，減少CD8通道的曝光時間），因為越長的曝光時間，越容易把背景和相近通道的信號曝光出來。

② 避免把會存在共表達的指標搭配波長相近染料，如CD3應用了TSA570，則CD8避開使用TSA620，可以選用相距較遠的TSA700或TSA520；另外在染色的時候，根據前期預實驗的結果，微調各指標的染色條件，比如單標染色發現CD3信號非常強，CD8相對CD3弱很多，在多染的時候染CD3可以再降低抗體濃度，縮短抗體孵育時間，以及染料孵育時間，或CD8增高抗體濃度，延長孵育時間，再搭配曝光時間的調整，也能有效避免信號串擾問題。

③ 如果儀器可以控制拍攝不同通道的順序，相鄰的通道也可以間隔開拍攝，因為熒光信號被激發以后，在信號比較強的情況下，會在片子上留存一段時間，如果緊接著拍攝鄰近的通道，有可能這個鄰近通道也會接收到上一個通道的殘留信號，因此可以考慮間隔開拍攝。