文章標題：Rapid, deep and precise profiling of the plasma proteome with multi-nanoparticle protein corona
發表期刊：Nature Communications
影響因子：17.694
作者單位：哈佛醫學院；Seer，美國（百趣生物蛋白冠™蛋白質組學技術研發單位）

研究背景
血漿蛋白質組的復雜性限制了大規模、無偏的蛋白質組學研究。該研究報道了一種可拓展、高效的蛋白質鑒定和定量平臺——蛋白冠技術，利用納米顆粒(nanoparticles, NPs)獨特的表面物化特性，可與蛋白組進行獨特的相互作用形成蛋白冠，從而實現血漿蛋白質組的深度檢測。在一項關于非小細胞肺癌的分類實驗中，通過5個NPs聯用，在141個血漿樣本中檢測出2000多種蛋白質。本文所描述的技術即通過蛋白質和NPs之間獨特的相互作用，結合精簡的工作流程，使得高深度、廣覆蓋的定量蛋白質組學研究成為現實。
 

圖1. 蛋白冠技術工作流程研究結果

1.NPs開發與表征
在蛋白冠的基礎研究中，開發了超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs, NP)，可以用于蛋白冠的自動化檢測。粒子的超順磁性核心促進蛋白冠與血漿的快速磁分離（<30秒），大大減少了LC-MS/MS提取NP蛋白冠所需的時間。 ，此外，不同的表面修飾，也有助于SPIONs產生不同的冠狀物模式，以更廣泛地研究蛋白質組。

根據先前公布的方法初步合成了3個具有不同表面化學成分的NPs（SP-003，SP-007和SP-011）（圖2）。 ，利用掃描電子顯微鏡(SEM)，動態光散射(DLS)，透射電子顯微鏡(TEM)，高分辨率TEM(HRTEM)和x射線光電子能譜(XPS)等技術對三種NPs的尺寸、形態和表面特性方面進行表征描述（圖2）。 ，DLS測量結果與掃描電鏡吻合，三種SPIONs為球形和半球形，平均尺寸均在200-300nm范圍內；ζ電位（ζ）分析表面電荷量，顯示pH值為7.4時，ζ值分別為-36.9，+25.8和-0.4mV，代表負、正和中性表面（圖2）；使用HRTEM評估涂層厚度，

對于SP-003，在氧化鐵芯周圍形成了厚度>10nm的非晶態殼層（圖2d），對于SP-007和SP-011，形成了相對較�。�<10nm）的非晶形態外殼（2i，n）；此外，通過XPS進行表面分析，證實了NPs成功包裹了各自的官能團。結構表征證實了三種SPIONs構成了一個多樣化的NPs測試集，之后對蛋白質的檢測覆蓋率、精度和響應線性度進行進一步評估。
 

圖2. 三種SPIONs的結構表征

2.蛋白質組學分析三種NPs的初始效果
使用DDA LC-MS/MS分析3種NPs panel，單個納米顆粒檢出蛋白數＞500，共檢出蛋白數＞700（圖3a）。SP-003，SP-007和SP-011三種NPs的中位CVs分別為19.6％、30.3％和17.0％（圖3b）。

為了探索NPs在大范圍濃度范圍內檢測血漿蛋白的能力， ，作者將上述三種NPs測量的蛋白質特征強度與已發表的數據進行了比較（圖3c），斜率的減小表明蛋白質信號強度的動態范圍隨豐度的變化而減小，即NPs可以通過親和力結合有效地歸一化蛋白質豐度，從而有效地降低蛋白冠中豐度的動態范圍，有利于低豐度蛋白的檢出。

為了確定平臺在生物標志物發現和驗證研究中的實際響應度，作者通過添加其他2種蛋白血管生成素和鈣衛蛋白（S100a8/9），包括3個附加的多肽和3個附加的NPs，對響應線性度進行了更深入的探索。 ，通過線性回歸對NPs檢測到的數據與ELISA結果進行了建模，證實了線性響應，并表明了NP平臺能夠高精度地測量寬動態范圍內肽段/蛋白質水平的相對變化。

之后為了探究背景干擾對蛋白冠組成的影響，文章對不同脂質水平和溶血程度下形成的蛋白冠進行了檢測。檢測結果顯示脂質水平的高低不會影響蛋白質檢出數量、組成或強度分布。此外還觀察到不同條件下蛋白質數量的穩健性，正常血漿中檢測到的重疊蛋白不受溶血引起的巨大背景變化的影響。
 

圖3. 三個原始NPs的蛋白質組學表征

3.十種NPs的優化組合
文章基于3種NPs的組合對蛋白質的檢測覆蓋率、精度和響應線性度進行了評估，之后為進一步拓展蛋白冠的檢測深度，對43個候選SPIONs進行篩選，最終產生一個由10個NPs組成的優化panel，CVs分布范圍為16.4％至30.8％（圖4b）。將定量結果與已發布的蛋白質組學數據集進行比較，檢測精度與檢測深度均要高于已發布的蛋白質組學數據集。 ，與血漿蛋白數據庫的比較結果顯示，10NPs-panel的蛋白組成幾乎覆蓋了數據庫的整個動態范圍。在目前已知的蛋白標志物研究中，多集中分布在高豐度范圍內，新型蛋白質生物標記物的出現率非常低（每年少于2種），10NPs-panel在90個生物標記物中，能夠在每個NPs和純血漿中鑒定出33至43個FDA標志物（圖4c），蛋白冠™蛋白質組學對于低豐度生物標志物的發現具有重要意義。

為了確定參考血漿蛋白質組中存在的功能類別，由Uniport ID向注釋數據庫(GOCC, GOBP, KEGG, Uniprot Keywords, Pfam)進行映射，并比較了10個NPs panel的富集結果。結果顯示出在分泌、先天免疫和囊泡等多種功能注釋上的顯著富集（圖4d），以及不同NPs之間在功能富集上的差異性（圖4e）。總的結果表明，NP冠狀物不僅可以根據單個蛋白質的水平進行分類，還可以根據蛋白質的功能基團進行分類。此外，NP富集不同功能類別蛋白質（即細胞外，細胞膜或細胞質）的能力說明了NP冠狀物在復雜蛋白質組中采樣的寬動態范圍。
 

圖4. 與純血漿相比，優化了10個NPs孔板

4.大規模應用：非小細胞肺癌研究
為了說明蛋白冠技術在大隊列研究中的應用，文章對NSCLC（非小細胞肺癌）受試者以及與年齡和性別相匹配的健康肺部合并癥對照受試者進行了快速而深入的血漿蛋白質組分析（圖5）。從最初的10個NPs中選擇5個組成panel，以最大限度地優化蛋白質組覆蓋率，進一步減少總的實驗時間。在整個研究過程中使用QC樣品評估精度。結果表明Proteograph可以在短時間內快速評估大量樣本，同時進一步提升精度和廣度。

為了研究早期NSCLC檢測的可能性，對80名健康受試者和61名早期NSCLC受試者組成的樣本集進行了分類建模，141位受試者在5種NPs中平均檢測到1664種蛋白質（圖5a），依靠無監督的聚類分析，由NPs檢測結果表現出不同的蛋白質豐度模式簇（圖5b）。

作者進一步將研究重點放在NPs中檢測到的而去高豐度蛋白血漿未檢測到的蛋白上，對它們發揮的作用展開了深入研究，使用隨機森林模型，量化了健康人群與早期NSCLC患者的分類表現，分析數據平均AUC為0.91（圖5c），受試者的隨機分類排列平均AUC僅達到0.51，這證實了分類器結果中不存在過度擬合的情況。檢查前20個分類器特征(NP和蛋白質組的組合)，按特征重要性排序，通過Open Targets(OT)注釋判斷，突出顯示已知和未知的蛋白質在NSCLC中發揮作用（圖5d）。在最重要的特征中，鑒定到了微管蛋白，它是化療藥物(包括紫杉醇及其衍生物)的靶點。此項研究為臨床隊列中使用多個NPs識別蛋白質生物標志物提供了參考依據。
 

圖5. 使用五個NPs對早期NSCLC與健康受試者進行分類

結論
本文介紹了高通量和自動化的蛋白質分離技術平臺(Proteograph)，該平臺從46種具有不同理化性質的NPs中篩選得到一組NPs整合到體外測定中，用于蛋白冠形成和LC-MS/MS分析，以實現無偏蛋白的收集/檢測。使用混樣（pool）血漿作為模型復雜的生物樣品，驗證了以下假設：較大的NP panel可識別更多的蛋白質，尤其是低豐度蛋白質。

在一組10個NPs的panel中發現了不同的蛋白質和與各自蛋白冠相關的蛋白質途徑，表明添加更多不同的NPs可以實現更廣泛和更深入的蛋白質組分析，因此類似于基因測序中不同的覆蓋水平，可以通過改變NPs的數量和類型來定制平臺，以在不同的水平上對蛋白質組進行分析。此前研究中使用相同的NP panel檢測到53種FDA批準的蛋白質生物標志物，但這些生物標記大多在高豐度范圍內被檢測到，鑒于NPs可以檢測到大量的低豐度蛋白，預測未來的研究將使用組合NPs來鑒定許多新穎的生物標記。