文章標題：Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy
發表期刊：Cell Metabolism
影響因子：31.373
作者單位：復旦大學附屬腫瘤醫院
發表時間：2022年10月
百趣生物提供服務：非靶代謝組+脂質組檢測分析

項目背景介紹
三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer ,TNBC)是臨床上一種異質性疾病，約占確診乳腺癌的15%。因異質性高、預后差、復發轉移風險高等特點，成為乳腺癌研究中亟需攻克的頑固“堡壘”。2019年邵志敏/江一舟團隊根據分子特征、代謝重編程和腫瘤微環境方面的異質性提出三陰乳腺癌的“復旦分型”，隨后又針對不同亞型進行了系列精準治療臨床試驗。與傳統化療相比，新的療法治療效果水平呈上升趨勢，但是低于預期。

鐵死亡（Ferroptosis）是一種非凋亡性和鐵依賴性細胞死亡方式，近年來在腫瘤研究領域表現活躍。在Fe2+或酯氧合酶的作用下，含多不飽和脂肪酸鏈的磷脂(PE-PUFAs)發生脂質過氧化，誘導細胞鐵死亡，這一過程受多種代謝途徑的調控，然而TNBC鐵死亡的特性仍未揭示。因此TNBC“復旦分型”仍需進一步的研究，探尋新的治療靶點，以發現TNBC新的治療突破口。

技術路線

研究結果
1.TNBC“復旦分型”各亞型鐵死亡具有異質性
本研究通過對TNBC轉錄組、非靶代謝組及脂質組數據集分析和驗證實驗證實“復旦分型”中各亞型鐵死亡存在異質性。代謝組學分享，間質樣亞型（Mesenchymal-like, MES）呈現HAMP（鐵穩態調節因子，圖1C）低表達和鐵代謝的失調(圖1E)；腔面雄激素受體亞型（luminal androgen receptor, LAR）與鐵死亡相關的代謝途徑被激活（圖1A），鐵死亡相關基因、蛋白及代謝物出現高度活躍(圖1B-F)；與LAR亞型相比，免疫調節亞型（immunomodulatory, IM)和基底樣免疫抑制亞型(basal-like and immune-suppressed, BLIS)鐵死亡相關通路變化水平較低，未出現顯著鐵死亡相關特性（圖1A）。這一結果表明LAR亞型是TNBC中鐵死亡敏感性最高的亞型。
 

圖1. TNBC各亞型中鐵死亡相關特征的異質性

2.谷胱甘肽（GSH）代謝中的GPX4是調控LAR亞型腫瘤鐵死亡的關鍵靶點

代謝組通路富集分析顯示，LAR亞型腫瘤GSH代謝顯著上調，GPX4在LAR亞型腫瘤中表達量高且對鐵死亡高度敏感（圖1F、圖2）。代謝組學分享，基于以上發現進行細胞和類器官的藥敏實驗，進一步探索了針對LAR亞型腫瘤鐵死亡的最佳治療策略，結果表明GPX4抑制劑RSL3對LAR亞型抑制效果更加明顯（圖3）。
 

圖2. GSH代謝是抑制LAR亞型腫瘤鐵死亡的關鍵
 

圖3. 不同敏感性的鐵死亡誘導劑突顯了GPX4在LAR亞型腫瘤中的重要性

3. 雄激素受體（AR）與GPX4啟動子結合，雙向調控LAR亞型腫瘤鐵死亡
為了探索LAR亞型腫瘤中GPX4表達增加的機制，作者首先對多組學數據進行分析，結果顯示AR信號通路密切相關的FA代謝、雄激素反應等通路與GPX4的表達呈現正相關（圖4A）。免疫印跡和qPCR的結果表明，AR對LAR亞型腫瘤中的GPX4起到調控作用（圖4B）。代謝組學分享，進一步的熒光素酶報告基因及ChIP-qPCR發現AR與GPX4-2500～-2000bp啟動子區的AR結合位點（AR binding sites, ABSs）結合并驅動GPX4的表達，從而調控LAR亞型中的GPX4高表達（圖4C）。
 

圖4. AR是LAR亞型腫瘤中GPX4表達的關鍵調控因子

基于AR對GPX4的調控作用，作者對AR抑制劑是否與GPX4抑制劑一樣，可以作為促進LAR亞型腫瘤鐵死亡的潛在抑制因子這一問題進行探究。代謝組學分享，通過免疫印跡、脂質過氧化檢測和BODIPY581/591C11染色對AR抑制劑和GPX4抑制劑誘導的LAR亞型腫瘤細胞系鐵死亡進行對比，AR抑制劑并未明顯提高腫瘤細胞內脂質過氧化水平（圖5A-C），究其原因是AR在細胞中的調控作用是雙向的，AR既可以促進鐵死亡相關多不飽和脂肪酸的生物合成，又可以上調GPX4的表達，減少引起鐵死亡的脂質過氧化（圖5D-E）。相較于抑制AR，GPX4抑制劑誘導LAR腫瘤鐵死亡的效果更佳。
 

圖5. AR具有雙重作用來調節鐵死亡

4.GPX4抑制劑抑制腫瘤生長、對腫瘤微環境進行重編
基于以上的體外研究，確定了LAR亞型的鐵死亡敏感性和GPX4抑制劑具有誘導鐵死亡作用。代謝組學分享，作者通過建立LAR亞型乳腺癌小鼠模型進行體內實驗（圖6A-B），發現無論是沉默Gpx4基因還是使用GPX4抑制劑都可以顯著誘導腫瘤細胞的鐵死亡，抑制腫瘤生長，增加CD8+、CD4+等不同亞群T細胞數量，觸發腫瘤微環境獲得炎癥表型，使LAR亞型腫瘤微環境由“冷”轉“熱”（圖6 C-F）。
 

圖6. GPX4抑制劑在體內抑制腫瘤生長并重新編程腫瘤微環境

5. GPX4抑制劑聯合ICB療法為LAR亞型腫瘤治療帶來新方向
為了測試GPX4抑制劑和免疫檢查點阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療是否起到協同作用，通過TS/A小鼠乳腺癌細胞系來建立TS/A異種移植瘤進行體內實驗（圖7A），結果顯示與單一治療相比，GPX4抑制劑和PD-1抗體聯合治療顯著抑制腫瘤生長，雖然未引起免疫細胞浸潤，但PRF1+CD8+T細胞和GZMB+CD8+T細胞的比例顯著增加，出現明顯免疫反應（圖7）。代謝組學分享，以上結果表明GPX4抑制劑與ICB聯合療法治療LAR亞型腫瘤是一種理想的治療策略，臨床免疫治療及小鼠細胞系免疫治療隊列研究也證實這一結果。
 

圖7. GPX4抑制劑與ICB聯用療法對LAR亞型腫瘤有顯著治療效果

結論
本研究通過多組學數據集分析和體內外實驗驗證系統地揭示了TNBC“復旦分型”各亞型具有鐵死亡異質性，其中LAR亞型腫瘤細胞ROS積累，FA代謝富集，脂氧合酶過度表達，并操縱GSH代謝防止鐵死亡的發生。代謝組學分享，且LAR亞型腫瘤對鐵死亡抑制劑、尤其是GPX4抑制劑敏感，是鐵死亡治療最為敏感的亞型。基于這些特征，靶向鐵死亡抑制劑與免疫檢查點阻斷相結合的療法，為LAR亞型腫瘤提供了精準治療新方向，為三陰性乳腺癌患者帶來新希望。