期刊：Science Advances（IF 14.98）
測序技術：空間轉錄組測序

導語
原發性肝癌（PLC）是死亡率第二高的腫瘤，其中肝細胞癌（HCC）和肝內膽管癌（ICC）是兩種主要的組織學亞型。病因包括慢性肝炎病毒感染、過度應激、藥物性肝損傷、黃曲霉毒素 B 暴露、未解決的炎癥和復雜性TME，都可能導致 PLC 的高度腫瘤內異質性。到目前為止，PLC幾乎沒有有效的非手術策略，并且缺乏有效的治療干預的特定藥物靶點。只有有限比例的HCC患者可以從現有的酪氨酸激酶抑制劑藥物（如索拉非尼）和免疫檢查點抑制劑中受益，這主要是由于腫瘤間和腫瘤內異質性。

科學問題
不同的 PLC 腫瘤生態系統提供了新的見解，并對癌癥干預具有潛在的益處。

科學技術
利用10x Genomics Visium平臺對這些切片進行空間轉錄組測序。

研究內容
異質性是癌癥預防和治療的主要挑戰。該研究首先構建了原發性肝癌(PLC)的高分辨率空間轉錄組圖譜，包含來自7名患者21個組織中的84,823個spot。將空間腫瘤微環境(TME)特征從非腫瘤區、邊緣區到腫瘤區進行漸進式比較，發現腫瘤包膜可能影響腫瘤內空間簇連續性、轉錄組多樣性和免疫細胞浸潤。在局部，該研究發現在100mm寬的簇-簇邊界上的雙向配體-受體相互作用有助于維持腫瘤內結構，而PROM1+和CD47+腫瘤干細胞龕位與TME重塑和腫瘤轉移有關。最后，該研究提出了一種TLS-50標記，用于在空間上精確定位三級淋巴樣結構(TLS)，并揭示了TLS的獨特組成是由它們與腫瘤細胞的距離決定的。

研究路線圖

研究結果
1. 利用空間轉錄組對原發性肝癌的結構探索
對于本研究中的Visium空間基因表達解決方案，根據 H&E 圖像顯示，每個Spot直徑達到 55 μm，捕獲大約 8-20 個細胞。測序數據顯示，每個點的基因中位數約為3000個。一般來說，腫瘤區域的 UMI 數量大于正常區域的數量，這與之前的研究一致。為了驗證轉錄組學特征是否與組織學信息一致，我們將 H&E 染色圖像與其對應的 ST 數據進行了比較。結果證實，由細胞類型標記基因表達定義的區域與病理圖像高度一致。具體而言，ALB和CYP2E1在正常區域高表達；腫瘤區域中的 GPC3 和 ARK1B10高表達；KRT19 在膽管癌區域高表達；COL1A1 在被膜和間質區域高表達。
 

2. 原發性肝癌空間異質性的不同表型
為了表征原發性肝癌的空間多樣性，該研究將來自每個患者不同部位的spot進行了聚類分析，并用UMAP展示。該研究發現HCC-1T、HCC-3T和HCC-4T中的聚類具有區域分布特征，而HCC-2T和cHC – 1T中的聚類是相互交織的。HCC-3L中的Cluster 5是一個獨特的Cluster，在HCC-3N和HCC-3T中都沒有出現。
 

該研究還使用基于基因的策略來比較不同亞群中不同細胞類型的得分。值得注意的是，間質區域的成纖維細胞和內皮細胞評分明顯較高，不同腫瘤簇區域的免疫細胞評分表現出高度的多樣性。通過擬合細胞類型得分的變化曲線（包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞(NK)、髓系細胞、內皮細胞和成纖維細胞），該研究發現與基質區域相關的簇狀細胞形成了成纖維細胞、內皮細胞甚至免疫細胞的變異表型：T細胞、B細胞、內皮細胞和成纖維細胞的變異模式是高度相似的，而NK細胞和髓細胞是高度變異的。
 

3. 腫瘤邊緣微環境特征
HCC-1、HCC-3和HCC-4中的腫瘤邊緣&腫瘤組織切片的腫瘤區域具有更高的空間連續性和更低的轉錄組多樣性。包膜完整的腫瘤組織具有較高的空間連續性和較低的轉錄組多樣性，其完整性與腫瘤細胞的空間異質性及其周圍間質和免疫細胞的分布密切相關。基因組變異分析發現，包膜完整性對正常和腫瘤區域的信號通路活性影響不大。
 

4. 原發性肝癌腫瘤內部異質性
通過每個腫瘤Cluster的標志通路活性的分層聚類分析，確定出兩個模塊，Module-1 顯示細胞周期和代謝相關通路的高活性；而 Module-2 在炎癥、血管生成和上皮-間質轉化方面具有更高的活性。HCC-1的腫瘤Cluster屬于兩個不同的模塊，T.2（在HCC-1T中代表Cluster2）為模塊2，T.5&6（在HCC-1T中代表Cluster5&Cluster6）為模塊1。從空間轉錄組數據推斷出的拷貝數變異大多與WES數據一致，這表明從空間轉錄組數據推斷出的拷貝數變異是可靠的。而且空間轉錄組數據在不同腫瘤簇之間產生了更微妙的拷貝數異質性。這些結果表明腫瘤內存在廣泛的空間異質性，某些腫瘤的不同亞群具有不同的通路活性和不同的細胞起源，不同亞群的細胞通訊可能對腫瘤的生態和進化至關重要。
 

5. 原發性肝癌異質性腫瘤干細胞（CSC）的功能分析
CSCs被認為是肝癌腫瘤內異質性的重要因素。不同的腫瘤干細胞標記物所定義的不同細胞亞群可能包含不同的致癌驅動因子。在這里，該研究集中探討了五種常用的肝癌干細胞相關標志物(CD47、EPCAM、KRT19、PROM1和SOX9)。對于每個標記物（marker），將每個患者腫瘤spot中表達量最高的前5%的spot定義為標記物陽性的CSC生態位。通過比較L/T/P部分CSC生態位的比例，該研究發現在HCC-2中，CD47-、SOX9-和PROM1陽性的比例逐漸增加，而EPCAM或KRT19基因并沒有表現出這樣的現象。
 

6. 三級淋巴結構（TLS）的空間分布及臨床特征
TLS是一種異位的淋巴結構，為DC的成熟、抗原呈遞以及T和B細胞的激活和分化提供了一個區域，這與抗腫瘤免疫反應和潛在的免疫治療反應有關。在這里，該研究注意到HCC-5的cluster 6具有高表達CXCL13、CCL19、CCL21、LTF、LTB、CD79A/B等的特征，這些都是TLS形成的必要分子。通過與H&E染色相結合分析，cluster6被鑒定為TLS區域。該研究選擇了cluster6中高特異性表達的前50個基因（TLS-50）作為特征基因，并測試了其識別TLS的能力。病理學家證實，與其他信號(包括乳腺癌、12-趨化因子、T輔助性1和B細胞、T濾泡輔助性細胞、CXCL13和漿細胞信號)相比，TLS-50可以識別信號噪聲比更高的TLS區域。通過使用TLS-50定位不同切片的TLS點，該研究發現它們主要存在于L切片而不是T和N切片，尤其是在L切片的非腫瘤區域。
 

參考文獻：
Wu R, Guo W, Qiu X, Wang S, Sui C, Lian Q, Wu J, Shan Y, Yang Z, Yang S, Wu T, Wang K, Zhu Y, Wang S, Liu C, Zhang Y, Zheng B, Li Z, Zhang Y, Shen S, Zhao Y, Wang W, Bao J, Hu J, Wu X, Jiang X, Wang H, Gu J, Chen L. Comprehensive analysis of spatial architecture in primary liver cancer. Sci Adv. 2021 Dec 17;7(51):eabg3750. doi: 10.1126/sciadv.abg3750. Epub 2021 Dec 17. PMID: 34919432; PMCID: PMC8683021.