單細胞轉錄組測序在小鼠大腦中的神經炎性星形膠質細胞亞型研究的應用
期刊： Nature neuroscience（IF 28.77）
測序技術：單細胞轉錄組測序，空間轉錄組測序
導語
使用脂多糖研究小鼠皮質星形膠質細胞在急性炎癥刺激后的轉錄組變化。發現星形膠質細胞的轉錄組變化發生在數小時內，隨著時間的推移急劇變化。通過對約80000個星形膠質細胞進行單細胞測序，發現炎癥引起廣譜的反應，亞型星形膠質細胞經歷了不同的炎癥轉變，并具有明確的轉錄組特征。利用轉空間錄組學將炎癥誘導的反應性星形膠質細胞的關鍵亞狀態定位于大腦區域。
方法
注射LPS誘導小鼠急性炎癥模型，注射3h、24h和72h，小鼠皮質分選星形膠質細胞，進行RNA-seq；注射24h及對照小鼠皮層分選星形膠質細胞，進行scRNA-seq和空間轉錄組測序。
結論
星形膠質細胞會在生物體感染、急性損傷和慢性神經退行性疾病中發生炎癥轉化。本文中，研究者通過使用脂多糖誘導小鼠急性炎癥，并對小鼠皮質星形膠質細胞的轉錄組進行分析。結果顯示星形膠質細胞在數小時內轉錄組發生了明顯的變化。星形膠質細胞亞型經歷了不同的炎癥轉變，各亞型具有明確的轉錄組圖譜。研究者還利用空間轉錄組學將炎癥誘導的反應性星形膠質細胞的關鍵亞狀態定位于特定的大腦區域。本研究為星形膠質細胞的異質性提供了重要的理論基礎，并將有助于理解區域受限反應性星形膠質細胞亞狀態的生物學重要性。
實驗思路
研究結果
1. 隨著時間的推移，星形膠質細胞獲得不同的炎癥狀態
研究星形膠質細胞時間依賴性轉錄組對炎癥的變化，研究者在出生后第30-35天（P30-35）向Aldh1l1eGFP報告小鼠腹腔注射LPS或無內毒素鹽水作為對照。注射LPS后3、24和72小時，對皮質星形膠質細胞進行熒光活化細胞分選純化，提取總RNA并處理以獲得大量RNA序列（圖1a）。研究者發現星形膠質細胞基因表達在3小時、24小時和72小時發生了廣泛變化（圖1b，c）。24小時的反應與之前發表的反應相似，常見的星形膠質細胞反應性標記物Gfap和Serpina3n在所有時間點都上調（圖1e）。然而，研究者發現，基因表達的變化大多是單個時間點獨有的（圖1d），在所有時間點，743個改變的基因中只有4%被誘導。例如，干擾素刺激基因（ISG）如IIgp1、Cxcl10和Gbp2在3小時時表達最高（圖1e、f）。在24小時，參與血管生成和血壓的基因如Fbln5、Agt和參與細胞外基質重塑的基因（包括Timp1）上調（圖1e、f）。
2. 復雜的星形細胞亞群分布在大腦中不同的區域
為了進一步了解星形膠質細胞的異質性，研究者接下來對來自注射LPS和鹽水的雄性和雌性Aldh1l1eGFP小鼠的星形膠質細胞進行scRNA-seq（圖2a）。使用細胞類型標記去除非星形細胞后，共保留79,944個細胞，鑒定到10個細胞類群(圖2b,c)，這些亞群可分為灰質/上層富集(亞群0、1、3和8)或白質/深層/次皮層(亞群 2、4、5、6、7和9)。為了確定研究者的星形膠質細胞亞群是否占據不同的解剖位置，研究者對3只鹽水處理小鼠和3只LPS處理小鼠大腦切片進行了空間轉錄組分析。通過星形膠質細胞特異性基因，如S100b或Aldh1l1的空間表達，結合單細胞轉錄組數據，確定了各細胞群的空間位置。
3. 星形膠質細胞對炎癥的反應是異質性的
為了了解單個集群對LPS誘導的炎癥的反應，研究者對各個亞群分別進行了差異分析。研究者觀察到，所有集群對LPS誘導的炎癥反應強烈（圖3b-d）。盡管大多數星形膠質細胞表現出重疊的基因誘導，但不同的亞群產生不同的炎癥反應（圖3c、d）。研究者發現每個亞群都有獨特的誘導基因，其中亞群4具有最多的亞群特異性DEG（圖3c）。然而，大多數基因在集群之間表現出復雜的協同調節，在9個集群中常見45個DEG（圖3c）。當觀察LPS誘導基因的亞群富集時，研究者再次觀察到炎癥基因的亞群特異性表達。例如，亞群8富含ISG，如Igtp、Tap1和Stat1。同時，亞群7誘導參與血管生成的基因，包括Agt、Cd34、Fbln5和Pgf。
4. 星形膠質細胞的反應亞群占據不同的解剖位置
亞群4占所有測序星形膠質細胞的5.9%，主要由炎癥標記物定義，包括Timp1、Gap43、Hspb1、Lcn2和Gfap。亞群4還表達通常由干擾素誘導的基因，包括Psmb8、Ifitm3和參與抗原呈遞的基因：H2-K1、H2-T23和H2-D1（圖4a–c）。研究者發現，在鹽水和LPS處理的動物中，第4亞群細胞存在于Gfap+白質束中，包括胼胝體，以及第三腦室和側腦室之間（圖2d和4d）。盡管亞群4在對照和炎癥小鼠大腦中被鑒定，受LPS誘導表達上述炎癥基因（圖3）。當探測亞群4基因模塊時，研究者發現LPS處理在所有Visium腦切片中都有強大的誘導作用（圖4e）。
與亞群4不同，亞群8對LPS表現出強烈的早期反應，是唯一一個幾乎完全存在于LPS處理的小鼠中的亞群（圖第5a、d）。亞群8表達的基因中的大多數是ISG，包括IFN依賴性轉錄的主要調節因子Stat1和Stat2。在亞群8中富集的其他基因包括參與抗原處理（Tap1和Tap2）和呈遞（H2-Q4、H2-K1、H2-Ab1、H2-D1和H2-T23）以及IFN誘導的GTP酶（Gbp3、Gbp7、Gbp2、Irgm1、Iigp1和Igtp）的基因（圖5b、c），提示這些星形膠質細胞暴露于干擾素，并使其抗原呈遞能力增加。空間轉錄組學顯示Cluster 8位于小鼠大腦的側腦室和第三腦室周圍、海馬下方以及腦表面。
5. 疾病模型中的干擾素反應性星形膠質細胞
鑒于其明確的炎癥特征，在明確炎癥特征的基礎上，研究者將本文的研究數據與前人發表的來自阿爾茨海默病小鼠模型、多發性硬化(MS)小鼠模型和急性刺傷模型的scRNA-seq數據集整合在一起分析，以期進一步探討亞群8是否存在于其他具有炎癥成分的疾病模型中。以上數據集單獨分析時，沒有發現8亞群星形膠質細胞，可能是因為這些研究中亞群8星形膠質細胞的占比較低(~2.7%)。而當所有數據集整合分析時，在人類疾病的慢性小鼠模型中，研究者發現星形膠質細胞表達亞群8基因，其表達部分依賴于Trem2（圖6a–c）。最后，在刺傷損傷的小鼠模型中也可以發現第亞群8星形膠質細胞（圖6g–i）。這些整合實驗提供了一種可能性，即盡管星形膠質細胞在單一損傷（例如LPS誘導的炎癥）內的反應存在異質性，但在幾種條件下，反應性星形膠質細胞的特定亞狀態存在一定的同質性。
參考文獻：
Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., & Liddelow, S. A. (2021). Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nature neuroscience, 24(10), 1475–1487. https://doi.org/10.1038/s41593-021-00905-6
