甲基化研究oxRRBS+RRBS揭示炎癥性腸病導致發育異常的表觀遺傳機制
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2020年12月31日，美國明尼蘇達大學Natalia Y. Tretyakova教授團隊在《Int J Mol Sci》雜志發表題為“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，該研究通過簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應的轉錄組測序（RNA-seq）揭示炎癥性腸病 (IBD)導致基因組中甲基化和羥甲基化模式變化，表明了IBD導致發育異常的表觀遺傳機制。
標題：Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model （Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中炎癥性腸病誘導增生/發育異常的多組學表征）
時間：2020-12-31
期刊：International Journal Of Molecular Sciences
影響因子：IF 6.208
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
假設表觀遺傳失調在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）和結腸癌發展之間的關聯中發揮作用。本研究對從肝螺桿菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收獲近端結腸組織，并進行DNA甲基化組、DNA羥甲基化組和轉錄組分析。RRBS和oxRRBS分析共鑒定出1606個差異甲基化區域（DMR）和3011個差異羥甲基化區域（DhMR），與胃腸疾病、炎性疾病和癌癥相關的基因和這些DMR/DhMR重疊。RNA-seq揭示了許多與炎癥和癌癥相關的基因顯著表達變化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在內的幾個基因在DNA甲基化/羥甲基化和基因表達水平上均表現出變化。總體而言，本研究結果表明，慢性炎癥會引發基因組中DNA甲基化和羥甲基化模式的變化，從而改變關鍵腫瘤發生基因的表達，并可能導致結直腸癌的發生。
項目設計：
（1）樣本選取：
IBD與正常小鼠近側腸道組織的5mC、5hmC、表達圖譜分析
（2）項目設計流程圖：
實驗結果
（1）肝螺桿菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠結腸組織的組織病理學分析
（2）炎癥性腸病（IBD）誘導的增生/發育異常中DNA甲基化和DNA羥甲基化表征
圖2：差異甲基化區域（DMR）和差異羥甲基化區域（DhMR）富集的基因在與癌癥發生和胃腸疾病相關的基因富集。
（3）差異甲基化分析揭示IBD誘導的增生/發育異常中存在廣泛的DMR和DhMR
圖3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus誘導炎癥在單核苷酸分辨率下的甲基化和羥甲基化動態變化
表1：H.hepaticus誘導的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎癥CpG位點IPA差異甲基化和羥基甲基化的經典通路
（4）IBD誘導增生/發育異常中的基因表達變化
（5）DNA甲基化異常調控差異表達基因的綜合分析
A. DNA表觀遺傳標記在IBD誘導的結直腸癌（CRC）發生中的作用的模型。
總結：
本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分別繪制了IBD誘導的DNA羥甲基化和DNA甲基化在全基因組中的變化。同時結合RNA-seq基因表達分析，研究結果首次全面揭示了結腸炎癥誘導的表觀遺傳學變化，為進一步研究IBD生物標志物的發現提供了有用的信息，并有可能促進IBD新療法的未來發展。
參考文獻：
Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.
2020年12月31日，美國明尼蘇達大學Natalia Y. Tretyakova教授團隊在《Int J Mol Sci》雜志發表題為“Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model”的研究文章，該研究通過簡化基因組甲基化測序（RRBS）+氧化簡化基因組甲基化測序（oxRRBS）及對應的轉錄組測序（RNA-seq）揭示炎癥性腸病 (IBD)導致基因組中甲基化和羥甲基化模式變化，表明了IBD導致發育異常的表觀遺傳機制。
時間：2020-12-31
期刊：International Journal Of Molecular Sciences
影響因子：IF 6.208
技術平臺：RRBS、oxRRBS、RNA-seq、RT-qPCR等
研究摘要：
假設表觀遺傳失調在炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）和結腸癌發展之間的關聯中發揮作用。本研究對從肝螺桿菌（H.hepaticus）感染的IBD小鼠模型中收獲近端結腸組織，并進行DNA甲基化組、DNA羥甲基化組和轉錄組分析。RRBS和oxRRBS分析共鑒定出1606個差異甲基化區域（DMR）和3011個差異羥甲基化區域（DhMR），與胃腸疾病、炎性疾病和癌癥相關的基因和這些DMR/DhMR重疊。RNA-seq揭示了許多與炎癥和癌癥相關的基因顯著表達變化，包括Duox2、Tgm2、Cdhr5和Hk2在內的幾個基因在DNA甲基化/羥甲基化和基因表達水平上均表現出變化。總體而言，本研究結果表明，慢性炎癥會引發基因組中DNA甲基化和羥甲基化模式的變化，從而改變關鍵腫瘤發生基因的表達，并可能導致結直腸癌的發生。
項目設計：
（1）樣本選取：
IBD與正常小鼠近側腸道組織的5mC、5hmC、表達圖譜分析
（2）項目設計流程圖：
實驗結果
（1）肝螺桿菌（H. hepaticus）感染的Rag2-/-/Il10-/-小鼠結腸組織的組織病理學分析
圖1：炎癥性腸病（IBD）與正常組織的組織病理學檢驗
A. 動物研究設計：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在6-7周齡時H.hepaticus感染或無菌培養基處理（對照），并在感染后20周處死
B. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和僅用鹽水處理的對照小鼠（藍色）的結腸組織的組織病理學結果：通過對胃腸道不同部位的炎癥、水腫、上皮缺陷、隱窩萎縮、增生和發育異常（Dysplasia）的個體評分求和來計算組織學活性指數（n=7）
C. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲腸每組n=4，橫結腸每組n=3，近端和遠端結腸每組n=7）
D. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）水平
B. 感染H.hepaticus（橙色）的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠和僅用鹽水處理的對照小鼠（藍色）的結腸組織的組織病理學結果：通過對胃腸道不同部位的炎癥、水腫、上皮缺陷、隱窩萎縮、增生和發育異常（Dysplasia）的個體評分求和來計算組織學活性指數（n=7）
C. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-甲基胞嘧啶（5mC）水平，（盲腸每組n=4，橫結腸每組n=3，近端和遠端結腸每組n=7）
D. 感染或未感染H.hepaticus的Rag2-/-/Il10-/-雄性小鼠胃腸道不同部位的整體5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）水平
（2）炎癥性腸病（IBD）誘導的增生/發育異常中DNA甲基化和DNA羥甲基化表征
圖2：差異甲基化區域（DMR）和差異羥甲基化區域（DhMR）富集的基因在與癌癥發生和胃腸疾病相關的基因富集。
A. RRBS和oxRRBS技術示意圖：通過比較RRBS和oxRRBS數據集分析5mC和5hmC水平。
B-C. 通過RRBS與oxRRBS結合鑒定1606個DMR（B）和3011個DhMR（C）的熱圖。
D-E. 通過Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受DMR（D）和DhMR（E）基因影響的功能和疾病。
B-C. 通過RRBS與oxRRBS結合鑒定1606個DMR（B）和3011個DhMR（C）的熱圖。
D-E. 通過Ingenuity Pathway Analysis（IPA），使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受DMR（D）和DhMR（E）基因影響的功能和疾病。
（3）差異甲基化分析揭示IBD誘導的增生/發育異常中存在廣泛的DMR和DhMR
圖3：Rag2-/-/Il10-/-小鼠在H.hepaticus誘導炎癥在單核苷酸分辨率下的甲基化和羥甲基化動態變化
A. 784個低DMR，822個高DMR，1454個低DhMR和1557個高DhMR的基因組分布餅圖
B. DMR/DhMR內每個CpG位點5mC和5hmC的動態變化。0.1是5mC/5hmC水平顯著性變化的截止值。數字代表點數量。
B. DMR/DhMR內每個CpG位點5mC和5hmC的動態變化。0.1是5mC/5hmC水平顯著性變化的截止值。數字代表點數量。
表1：H.hepaticus誘導的Rag2−/−/Il10−/−小鼠炎癥CpG位點IPA差異甲基化和羥基甲基化的經典通路
（4）IBD誘導增生/發育異常中的基因表達變化
圖4：炎癥性腸病（IBD）和對照小鼠中近端結腸的轉錄組分析
A. 基于最高方差的500個基因的無監督分層聚類，顯示對照組和IBD組之間明顯分離
B. IPA鑒定上游調控因子Il10ra周圍的網絡
C. 使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受差異表達基因影響的疾病和功能
B. IPA鑒定上游調控因子Il10ra周圍的網絡
C. 使用顯著性閾值p=0.05的Fisher精確檢驗，預測受差異表達基因影響的疾病和功能
（5）DNA甲基化異常調控差異表達基因的綜合分析
圖5：IBD誘導的轉錄組、DNA甲基化組和羥甲基化組變化之間的相關性
A-B. 差異表達且DMR（A）或DhMR（B）富集的基因散點圖。顏色表示不同基因組表征，點大小表示每個區域的CpG數量。A. DNA表觀遺傳標記在IBD誘導的結直腸癌（CRC）發生中的作用的模型。
總結：
本研究采用RRBS+oxRRBS在H.hepaticus感染的IBD Rag2-/-/Il10-/-小鼠模型中，分別繪制了IBD誘導的DNA羥甲基化和DNA甲基化在全基因組中的變化。同時結合RNA-seq基因表達分析，研究結果首次全面揭示了結腸炎癥誘導的表觀遺傳學變化，為進一步研究IBD生物標志物的發現提供了有用的信息，并有可能促進IBD新療法的未來發展。
參考文獻：
Han Q, Kono TJY, Knutson CG, Parry NM, Seiler CL, Fox JG, Tannenbaum SR, Tretyakova NY. Multi-Omics Characterization of Inflammatory Bowel Disease-Induced Hyperplasia/Dysplasia in the Rag2-/-/Il10-/- Mouse Model. Int J Mol Sci. 2020 Dec 31;22(1) pii: ijms22010364.
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