2022年3月9日，Genome Biology在線發(fā)表了華中農業(yè)大學李青課題組團隊題為“DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm”的研究論文。該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）與對應的轉錄組關聯(lián)分析揭示了DNA去甲基化酶影響籽粒發(fā)育相關基因表達的生物學功能及相關機制，為玉米籽粒產量的遺傳改良提供了重要理論支撐。


標題：DNA demethylation affects imprinted gene expression in maize endosperm
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 13.583
發(fā)表時間：2022.03.09
技術平臺：WGBS、RNA-seq、DAP-seq、qRT-PCR、表型和印記分析
 
背景：
DNA去甲基化發(fā)生在許多物種中，并涉及多種生物過程。然而玉米中DNA去甲基化的發(fā)生和作用仍然未知。玉米籽粒主要由胚和胚乳組成，基因表達在籽粒發(fā)育過程中起著重要的作用。印記現(xiàn)象是玉米胚乳中的一種特異表達模式，即來自雙親的等位基因在胚乳中只有一方表達，只有母本等位基因表達的稱為MEG（Maternally Expressed Genes），只有父本等位基因表達的稱為PEG（Paternally Expressed Genes）。然而，調控玉米籽粒胚乳印記基因表達的表觀遺傳學機制尚不清楚。
 
方法：
作者對玉米中兩個調控表觀修飾的關鍵基因（ZmROS1a和ZmROS1b，均屬于B73遺傳）進行詳細的研究。從野生型（WT）、ZmROS1a突變體、ZmROS1b突變體、ZmROS1a和ZmROS1b雜交的雙突變體（ZmROS1ab）、WT（或雙突變體）和自交系Mo17的F1雜交品系中收集自花授粉14天后的胚和胚乳。樣品立即在液氮中冷凍，并儲存在-80°C中，隨后進行WGBS、RNA-seq、表型和印跡分析等。
 
結果：
作者分析了編碼DNA去甲基化酶的兩個關鍵基因（ZmROS1a和ZmROS1b）功能缺失突變體。結果顯示在突變體中未檢測到DNA甲基化顯著變化，但在基因和一些轉座子周圍的突變體中檢測到DNA甲基化水平增加。DNA甲基化水平的增加伴隨著基因表達下調改變，特別是在胚乳中表達的基因中。母本印記基因表達和父本基因印記表達在F1雜交品系中都發(fā)生了變化（突變體為雌性親本、野生型為雄性親本），但在互惠雜交中沒有變化。此外，基因表達改變伴隨著等位基因特異性DNA甲基化水平差異，表明DNA甲基化的變異直接調控玉米胚乳印記基因的表達。最后，作者證明雙突變體中的高甲基化與轉錄因子靶標結合位點的減少和基因表達的改變相關。
 
（1）ZmROS1a突變體、ZmROS1b突變體、雙突變體ZmROS1ab的表征


圖1 ：WT和突變體的DNA甲基化水平比較

1. ZmROS1a和ZmROS1b的基因結構
2. 突變體和WT的全基因組DNA 甲基化水平
3. CG、CHG 和 CHH 位點（上）和 TE（下）周圍的 DNA 甲基化水平

（2）ZmROS1ab雙突變體的全基因組DNA甲基化模式
圖2：ZmROS1ab 雙突變體DMR表征

1. 胚和胚乳中WT和ZmROS1ab突變體的DMR。
2. 在WT 中胚胎和胚乳的 DMR。
3. a的DMR 與b的 DMR 重疊。
4. c圖的DMR重疊DNA 甲基化水平熱圖。
5. “ ZmROS1ab敏感” DMR的基因組特征。

 

（3）ZmROS1ab 調控胚乳基因表達
圖3：ZmROS1ab調控胚乳基因表達。

1. ZmROS1ab敏感基因更有可能在胚乳中表現(xiàn)出差異表達。
2. 大部分ZmROS1ab敏感DEG顯示下調（P<0.001）。
3. ZmROS1ab敏感DEG的組織表達模式。
4. 在胚乳中表達的ZmROS1ab敏感基因更有可能表現(xiàn)出差異表達。
5. 在胚乳中表達的ZmROS1ab敏感DEG更可能表現(xiàn)出下調。
6. 跨組織和ZmROS1ab突變體的ZmROS1ab敏感 DEG的 DNA 甲基化譜。
7. 三種情況下的DNA甲基化水平和在胚乳中特異性基因的表達水平。
8. WT和ZmROS1ab突變體所有表達基因和胚乳特異性基因的表達水平熱圖。
9. WT和Zmros1ab的差異倍數(shù)變化分布。

（4）ZmROS1ab與胚乳印跡基因表達

圖4：作為母本基因遺傳時，ZmROS1ab調控胚乳印記表達

1. 胚乳印記基因的鑒定。
2. bM和BM F1雜交品系差異表達的MEG和PEG表達水平。
3. MEG和PEG的組織表達模式。
4. BM和bM雜交中母本reads比較

（5）印跡基因表達變化與 DNA 甲基化水平變化
圖5：胚乳印記基因表達與DNA甲基化有關
a和b. 兩個等位基因在野生型BM雜交或MEG（a）和PEG（b）突變型bM雜交中的表達。RT-PCR（右圖）和RNA-seq（左圖中的條形圖）結果。
c和d. 重亞硫酸鹽PCR檢測a（c）的MEG和b（d）的PEG甲基化水平
 

（6）ZmROS1ab突變體DNA 甲基化水平與轉錄因子結合位點

圖6：ZmROS1ab誘導的DNA去甲基化影響轉錄因子（TF）結合。

1. WT和ZmROS1ab突變體發(fā)現(xiàn)ZmO2結合peaks重疊。
2. 鑒定WT和Zmros1ab突變體的差異peaks。
3. 比較差異peaks和非差異peaks的DNA甲基化水平。（P<0.001,ns不顯著）
4. IGV視圖顯示W(wǎng)T和突變體ZmO2的差異結合。

結論：
以上研究結果證明DNA甲基化的變異直接調控玉米胚乳印記基因的表達，揭示了DNA去甲基化酶影響籽粒發(fā)育相關基因表達的生物學功能及相關機制，為玉米籽粒產量的遺傳改良提供了重要理論支撐。


 
關于植物DNA甲基化研究
（1）植物中的DNA甲基化
對于植物而言，面對生長環(huán)境的改變，表觀遺傳的變異會改變植物DNA的構象，從而改變染色質和蛋白質的結構，達到調節(jié)基因組的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時，植物基因組中DNA甲基化會發(fā)生改變，并且這些改變會遺傳給后代。所以DNA甲基化的改變能夠豐富植物物種的多樣性，加強植物的環(huán)境適應性。
不同于哺乳動物基因組只有CG甲基化，植物基因組甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的堿基）甲基化。而維持這三種不同的DNA甲基化的分子機制非常復雜。



（2）植物中的DNA甲基化研究技術



（3）植物DNA甲基化研究思路
植物DNA甲基化一般遵循三個步驟進行數(shù)據(jù)挖掘。首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數(shù)據(jù)的分析策略、DMG的功能分析等。最后，將甲基化組學&轉錄組學關聯(lián)分析，包括Meta genes整體關聯(lián)、DMG-DEG對應關聯(lián)、網(wǎng)絡關聯(lián)等。


參考文獻：https://doi.org/10.1186/s13059-022-02641-x