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文獻科普:m6A甲基化修飾在神經元發(fā)育和成體神經形成中的作用研究

瀏覽次數:574 發(fā)布日期:2023-3-3  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
近年來研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在哺乳動物神經系統(tǒng)的mRNA中普遍存在,并在胚胎期和產后神經元發(fā)育過程中表現(xiàn)出動態(tài)特征。浙江大學醫(yī)學院李學坤教授團隊多組學聯(lián)合分析揭示了m6A修飾通過調節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調控神經形成和神經元發(fā)育,進一步驗證了m6A甲基化修飾在神經元發(fā)育和成體神經形成中的作用。
 

標題:m6A Regulates Neurogenesis and Neuronal Development by Modulating Histone Methyltransferase Ezh2(m6A修飾通過調節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2來調控神經形成和神經元發(fā)育)
時間:2019.4
期刊:Genomics Proteomics Bioinformatics
影響因子:IF 7.691
技術平臺:MeRIP-seq、m6A MeRIP-qPCR、RNA-seq、ChIP

摘要:
m6A甲基化酶由Mettl3和Mettl14組成,是mRNA中最豐富的RNA修飾,參與多種生物過程。然而,m6A修飾在調控神經元發(fā)育和成體神經形成中的作用和確切機制尚不清楚。在本研究種,作者檢測了Mettl3在小鼠神經元發(fā)育和成體神經形成中的功能,結果發(fā)現(xiàn)Mettl3沉默導致成體神經干細胞(adult neural stem cells,ANSC)中m6A修飾水平顯著下調,并影響了細胞增殖。Mettl3沉默不僅影響神經元發(fā)育,使ANSC分化更傾向于膠質細胞系,而且還影響了新生神經元的形態(tài)成熟。m6A-seq(MeRIP-seq)測序分析結果顯示m6A修飾主要富集在與神經形成和神經元發(fā)育相關的轉錄本中。從機制上講,m6A修飾存在于組蛋白甲基轉移酶Ezh2的轉錄本上,mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調,ChIP實驗證明H3K27me3水平下調。免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復。總之,研究結果揭示了RNA修飾和組蛋白修飾之間的串擾,并表明Mettl3介導的m6A修飾通過調節(jié)組蛋白甲基轉移酶Ezh2表達在調控成體神經形成和神經元發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
 
實驗方法和流程設計

結果
(1)小鼠神經干細胞發(fā)育中mettl3的表達動態(tài)
(A-D)神經干細胞增殖和分化中mettl3表達動態(tài)的免疫熒光觀察
(E-F)Western blot檢測m6A甲基化酶mettl3和mettl14在增殖和分化中的變化
(I)Dot blot和MS檢測增殖和分化過程中總體m6A修飾水平的變化
 
(2)m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞增殖
 
(A-B)mettl3沉默實驗:RT-PCR和WB驗證其表達沉默成功
(C-D)Dot blot和MS驗證mettl3沉默導致的m6A修飾水平下調
(E-G)免疫熒光觀察:mettl3沉默影響了細胞增殖
(H)RT-PCR檢測mettl3沉默導致多種細胞周期蛋白mRNA水平下調
(I-K)流式細胞術分析沉默后細胞周期狀態(tài)發(fā)生改變

(3)m6A甲基化酶mettl3調控神經干細胞分化和發(fā)育
(A-E)免疫熒光觀察:mettl3沉默和過表達對神經干細胞分化的影響(Tuj1為神經元細胞標志物,GFAP為星形膠質細胞標志物)
(F-G)Western blot:mettl3沉默和過表達對神經干細胞分化的影響
(H-L)Sholl分析檢測mettl3沉默和過表達對新生神經元細胞和海馬神經元的影響
(I-K)原位電穿孔圖像分析mettl3沉默對神經元的數量和長度的影響

(4)神經干細胞從增殖到分化的m6A修飾動態(tài)
(A-B)增殖和分化細胞的m6A修飾在轉錄本上的分布比較
(C)增殖和分化細胞的m6A修飾區(qū)域motif分析
(D)增殖和分化細胞中m6A修飾基因的重疊分析
(E-G)共有基因和獨有基因的GO功能富集分析
(H)m6A修飾基因和差異表達基因的重疊分析
(I)具有m6A修飾的差異表達基因的GO分析
(J)增殖和分化細胞中幾個差異m6A修飾基因的IGV展示

(5)mettl3通過m6A修飾調節(jié)基因表達,進而影響神經細胞增殖
(A)mettl3沉默樣本的m6Apeak分布、motif分析
(B)mettl3沉默前后的差異表達基因和m6A修飾基因的重疊分析
(C)組學關聯(lián)分析火山圖(九象限圖的另一個版本)
(D-E)mettl3沉默后有m6A修飾的上調和下調差異表達基因的GO分析
(F)四個與神經發(fā)育功能相關基因在mettl3沉默后m6A修飾水平降低
(G)m6A修飾的差異表達基因功能網絡

(6)Ezh2受Mettl3調控,可挽救Mettl3基因下調引起的神經元發(fā)育和神經發(fā)生缺陷

(A-C)mettl3沉默導致Ezh2蛋白表達水平下調,CHIP實驗證明H3K27me3水平下調。
(D-E)mettl3沉默和Ezh2 m6A修飾區(qū)引入突變,都不影響Ezh2的mRNA水平
(F-I)免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn),mettl3沉默引起的神經細胞增殖和分化缺陷可被Ezh2過表達所回復
(D)Ezh2過表達挽救了受損的新生神經元的形態(tài)成熟

參考文獻:https://doi.org/10.1016/j.gpb.2018.12.007
發(fā)布者:深圳市易基因科技有限公司
聯(lián)系電話:0755-28317900
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