人腦脊液的代謝組學研究應用：為神經性疾病生物標志物的發現提供參考
百趣代謝組學分享，腦疾病病人的腦脊液（CSF）通常用來診斷和監測研究，但是惡性膠質瘤病人腦脊液組成的變化很少被人們所知。該研究作者建立了靶向代謝組學分析方法，采用SRM監測模式，使用正負離子切換的方法在CSF中鑒定到了124種極性代謝物。樣品來源于10例膠質瘤病人與7例對照。百趣代謝組學解讀，采用多種統計手段對數據進行分析，為神經性疾病生物標志物的發現提供參考。
10位膠質瘤病人包含4例新診斷的膠質瘤病人及6例復發病人。7例對照未診斷出任何膠質瘤。除了3號病人通過腦室采集CSF外，其余均通過腰椎穿刺采集。樣品采自27-67歲的男性和女性患者，樣品保存于-80℃冰箱直至測定。同時測定了一些臨床指標如白細胞計數、血清總蛋白水平、血糖水平、LDH水平等（見表1）。測定的腫瘤指標包括腫瘤進程、生存期、腫瘤大小等。對于CSF的前處理，作者向250μL腦脊液樣品中加入80%甲醇，-20℃下沉淀蛋白過夜。之后在4℃下13000rpm離心10min。取上清液吹干，用50μL水-乙腈（95:5）復溶。13000rpm離心5min，取上清液吹干，保存于-80℃冰箱。樣品用20μL水（質譜級）復溶，取10μL進液質分析。
表1膠質瘤病人的基本信息及臨床參數
所有的統計計算使用CRAN軟件完成（http://www.r-project.org/）。只要是在某一個樣本中未檢測到的化合物都被舍棄，保證分析結果更可靠。這一步使得化合物數量從254個降低到124種。代謝組學分享，之后作者使用PCA分析、分層聚類、k均值聚類分析對數據進行挖掘，并利用KEGG數據庫分析代謝通路。
惡性神經膠質瘤CSF特有的代謝特征：采用無監督的分層聚類算法發現，膠質瘤病人CSF與對照組相比，其中代謝物水平有升高或降低（圖1A）。樹狀圖（圖1B）顯示的三個分支分別代表兩組膠質瘤病人和一組正常樣本。有意思的是，新診斷的膠質瘤病人（1、2、5、7號）與其他樣本不在同一分支。圖1C顯示了區分膠質瘤和正常樣本的各個代謝物做出的貢獻。代謝組學分享，總之，這種分層聚類算法不僅區分了膠質瘤病人和對照組，而且還能夠區分新診斷的膠質瘤病人和復發病人。這些信息是無法從MRI上獲得的。
圖1 CSF代謝物組成的分層聚類分析
作者也進行了PCA分析，發現前3種主成分表現出顯著性差異（*，p=8.3×10-15; ** ,p=2.6×10-5; ***, p=1.8×10-9），分別占變異的28.1%、15.3%、13.9%（圖2A）。為了進一步解釋這些成分，作者將前40個主成分導入KEGG數據庫，得到代謝物的通路分析結果。其中嘧啶代謝對2種主成分都做出了貢獻（圖2C）。代謝物來自三羧酸循環（n=5）、糖異生（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第一個主成分做出貢獻；代謝物來自尿素循環（n=4）、嘧啶代謝（n=4）為第2種主成分做出貢獻；代謝物來自蛋白質生物合成（n=7）、尿素循環（n=4）、嘌呤代謝（n=4）為第3種主成分做出了貢獻。這些發現說明體內生化反應可以區分膠質瘤和正常樣本。
代謝物在前兩種主成分下的得分圖如圖2D，可以看出膠質瘤病人聚成兩簇，并且與正常樣本相區分。采用k均值聚類分析，將不同化合物對各簇的貢獻標示以不同的顏色，發現結果相同。說明無論是分層聚類、PCA還是k均值聚類分析都可以獲得相同的結果，只是利用數據的不同方面。
圖2 CSF代謝物組成的PCA分析及k均值聚類分析
作者接下來分析了膠質瘤與正常樣本存在差異的化合物，采用雙側t檢驗分析，39個化合物存在顯著性差異（p<0.05）（圖3A，表2）。這些代謝物來源于多種代謝途徑，包括氨基酸、脂質、嘧啶、中心碳原子代謝。膠質瘤對代謝的改變直接來源于體細胞突變，比如MYC擴增、PTEN缺失、蛋白質丟失、EGFR擴增、IDH1/IDH2突變。
代謝組學分享，作者在3號病人腦脊液中檢測到高水平的2-羥戊二酸，說明此病人可能是IDH1突變的膠質瘤；腫瘤復發病人（3、10號）樣本中發現三羧酸循環中的代謝物顯著富集（圖3B），說明這些化合物可以用來提示腫瘤復發的可能；新診斷的膠質瘤病人中發現有7種代謝物與復發病人存在顯著性差異（p<0.05）（圖3C）。其中有很多代謝物涉及組氨酸和色氨酸代謝，包括吲哚乙酸、吲哚、組氨酸、鄰氨基苯甲酸鹽。這條代謝途徑中的吲哚2,3加氧酶通常作為免疫功能的一個生物標志物，故上述代謝物水平的變化可以反映這些病人的免疫功能變化。
表2膠質瘤病人與對照組相比代謝物的變化情況
圖3惡性膠質瘤類型的代謝物特征分析及與臨床指標相關性分析
與臨床參數的相關性：臨床上采用兩個參數來評價膠質瘤病人的腫瘤大小，分別是Tgad和FLAIR。代謝組學分享，作者將以上兩種手段觀察到的腫瘤大小與檢測的代謝物關聯起來，發現有8個代謝物與Tgad相關，10個代謝物與FLAIR相關（R2>0.50）。并且有6個代謝物與Tgad和FLAIR均相關， 4個呈正相關，2個呈負相關；另一感興趣的指標是生存期，作者發現有14個代謝物與生存期相關（R2>0.50）。（表3）其中3個代謝物（泛酸酯、生物素、氨基乙磺酸）可從食物中攝取故在CSF中能夠檢測到，其余代謝物為核苷酸和氨基酸代謝的中間產物。
CSF中肌醇水平降低，膽固醇硫酸酯水平升高與Tgad和FLAIR檢測到的腫瘤大小呈線性相關（圖3D）。代謝組學分享，肌醇是一個腦滲透性化合物，用磁共振光譜檢測，其在惡性膠質瘤和細胞瘤中的水平比低級別膠質瘤和正常腦組織中的水平低。該研究也顯示腫瘤大小與CSF中肌醇水平呈負相關；CSF中膽固醇硫酸酯水平與腫瘤大小正相關。膽固醇硫酸酯參與人支氣管上皮細胞鱗狀上皮生化過程，這也就暗示該代謝物來自正常組織的致癌性轉化。
表3與臨床指標Tgad、FLAIR、生存期相關的代謝物
作者等人用惡性膠質瘤的小組樣本，構建了人腦脊液的整體代謝組學輪廓。研究發現，用少量樣本即可以顯著區分膠質瘤病人與正常病人。開發了一種正負離子模式切換的LC-MS/MS方法用于代謝物檢測。采用無監督的分類算法來尋找病人樣本間的總體差異，并研究與系統性癌癥相關代謝的生理學特點。盡管該研究中的樣本量較小，但某些代謝物水平的顯著差異暗示從腦脊液中發現代謝生物標志物有很大潛力，代謝物特征同樣可以作為診斷標志物。代謝組學分享，作者等人希望該研究可以擴展代謝組學技術的適用性，并且促進CSF中的代謝物分析為未來大樣本的腫瘤學臨床研究提供參考。
參考文獻：Jason W. Locasale, Tamar Melman, Susan Song,etal. Metabolomics of Human Cerebrospinal Fluid Identifies Signatures of Malignant Glioma. [J]. Mol. Cell. Proteomics 11, 2012, 1–12.
