近日，復(fù)旦大學(xué)青年研究員鄭義艷團(tuán)隊(duì)在期刊Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF：6.081）上發(fā)表了題為Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning的研究論文，在卵巢癌中報(bào)道了絲狀肌動(dòng)蛋白的潛在機(jī)制。該研究中的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海生物芯片有限公司（生物芯片上海國(guó)家工程研究中心）完成。

 

研究?jī)?nèi)容

絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin/F-肌動(dòng)蛋白）和球狀肌動(dòng)蛋白存在于體細(xì)胞的細(xì)胞核中，并參與了染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA損傷修復(fù)。然而，細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白在細(xì)胞中聚合的潛在機(jī)制仍未得到完全理解。此研究使用小分子抑制劑庫(kù)篩選并結(jié)合了深度學(xué)習(xí)的方法，確定了參與卵巢癌細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白聚合的潛在激酶靶點(diǎn)。研究中使用的抑制劑的靶點(diǎn)分析表明，PI3K-AKT通路參與調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白組織。此研究為揭示核F-肌動(dòng)蛋白在卵巢癌中的重要作用以及理解核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)是如何組織的奠定了基礎(chǔ)。

 

文章詳情

文章題目：Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning

中文題目：通過(guò)高通量篩選結(jié)合深度學(xué)習(xí)來(lái)研究細(xì)胞核絲狀肌動(dòng)蛋白組織在卵巢癌中的潛在機(jī)制

發(fā)表時(shí)間：2022.05

期刊名稱：Frontiers in Cell and Developmental Biology

影響因子：6.081

DOI：10.3389/fcell.2022.869531

 

研究思路

• 卵巢癌細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的特征分析

研究者以卵巢癌為模型，研究細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白是否存在于癌細(xì)胞中。研究者制備了多種穩(wěn)定表達(dá)nAc-citrine的卵巢癌細(xì)胞系。nAc(核肌動(dòng)蛋白染色體)是核肌動(dòng)蛋白結(jié)合探針，其可與熒光標(biāo)簽citrine熔合。利用該探針，研究者在不同卵巢癌細(xì)胞系中檢測(cè)了細(xì)胞核中的F-肌動(dòng)蛋白，不同細(xì)胞系表達(dá)核F-肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞比例不同(圖1A-C)。尤其在OVCA432-nAc-citrine細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白的占比可達(dá)到約70%(圖1C)。在其他細(xì)胞系中，如HEY-nAc-citrine中核F-肌動(dòng)蛋白的占比很少(圖1C)。研究者進(jìn)一步分析了卵巢癌細(xì)胞株OVCA432中核肌動(dòng)蛋白絲的數(shù)量、厚度和長(zhǎng)度(補(bǔ)充圖S1A-C)。隨后他們進(jìn)行了z-slice分析，結(jié)果證實(shí)了nAc-citrine細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合了F-肌動(dòng)蛋白 (圖1D)。此外，層蛋白A/C染色顯示F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)沒(méi)有延伸出核膜(圖1E)。這些分析表明，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白組裝發(fā)生在卵巢癌細(xì)胞系的細(xì)胞核中。并且在沒(méi)有nAc-citrine表達(dá)的SKOV3細(xì)胞系中，通過(guò)phalloidin染色證實(shí)了核F-肌動(dòng)蛋白的存在(圖1F)，表明獲得的核F-肌動(dòng)蛋白信號(hào)不是nAc-citrine標(biāo)記和/或異位表達(dá)的偽信號(hào)。為了研究nAc-citrine的過(guò)表達(dá)是否有助于調(diào)控卵巢癌細(xì)胞系的基因表達(dá)，研究者對(duì)OVCA432-nAc-citrine和OVCA432細(xì)胞進(jìn)行了Bulk RNA測(cè)序來(lái)比較他們的轉(zhuǎn)錄譜。飽和度分析顯示，OVCA432- nAc -citrine細(xì)胞和OVCA432細(xì)胞具有相似的曲線(補(bǔ)充圖S1D)，說(shuō)明這兩種細(xì)胞的總RNA質(zhì)量相似。同時(shí)，OVCA432-nAc-citrine與OVCA432之間的差異表達(dá)基因非常少(補(bǔ)充圖S1E)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)nAc-citrine不可能在整體水平上重塑基因表達(dá)。這表明，在卵巢癌細(xì)胞系中使用nAc-citrine探針標(biāo)記核F-肌動(dòng)蛋白是可行的。

為了進(jìn)一步研究三維培養(yǎng)物中的核F-肌動(dòng)蛋白組織，研究者生產(chǎn)了SKOV3細(xì)胞的球狀體，其穩(wěn)定地表達(dá)lifeact（F-肌動(dòng)蛋白結(jié)合探針），并與熒光標(biāo)簽citrine融合。在3D培養(yǎng)中，他們檢測(cè)到明顯的核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)(圖1G,H)。為了進(jìn)一步表征核F-肌動(dòng)蛋白組織的新生特征，他們又對(duì)SKOV3-nAc-citrine細(xì)胞進(jìn)行了活細(xì)胞成像，并記錄了核中F-肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的形成不是暫時(shí)的(補(bǔ)充 Videos S1-S3，此處未列出)。

對(duì)卵巢癌細(xì)胞系中核F-肌動(dòng)蛋白組織的分析促使研究者在卵巢癌患者的腫瘤細(xì)胞中檢查這些結(jié)構(gòu)的存在。在細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白染色前，PAX8免疫熒光證實(shí)了新鮮冷凍腫瘤切片中存在卵巢癌細(xì)胞(補(bǔ)充圖S2A)。具有代表性的圖像顯示，高級(jí)別漿液性卵巢癌患者的腫瘤細(xì)胞中存在核F-肌動(dòng)蛋白(圖1I,J)。研究者使用z-slice分析進(jìn)一步證實(shí)這些F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)存在于細(xì)胞核內(nèi)(圖1K,L)。隨后研究者使用Imaris通過(guò)一系列phalloidin染色連續(xù)圖像重建了細(xì)胞核內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的3D模型，其中具有代表性的圖像如圖1I,J所示。再次證實(shí)了細(xì)胞核內(nèi)明顯可見(jiàn)F-肌動(dòng)蛋白組織(圖1M and 補(bǔ)充Video S4，Video此處未列出)。此外，他們使用同一卵巢癌患者的另一個(gè)腫瘤切片在癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這些核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充圖S2B-E)。

圖1 卵巢癌細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)的特征 補(bǔ)充圖1 補(bǔ)充圖2

 

• 卵巢癌細(xì)胞中調(diào)節(jié)核F-肌動(dòng)蛋白組裝的激酶的鑒定

為了解剖卵巢癌細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白聚合的機(jī)制，研究者重點(diǎn)關(guān)注激酶靶點(diǎn)。他們利用商業(yè)小分子抑制劑庫(kù)TargetMol和高通量篩選系統(tǒng)(High-Content Screening system, HCS)在卵巢癌細(xì)胞中尋找參與核F-肌動(dòng)蛋白組織的潛在激酶靶點(diǎn)。由于OVCA432-nAc-citrine細(xì)胞系在細(xì)胞核中具有顯著的F-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，他們使用來(lái)自TargetMol文庫(kù)的單個(gè)小激酶抑制劑處理這些細(xì)胞，該文庫(kù)包含1247個(gè)小分子抑制劑。篩選流程如圖2A所示。研究者選擇BMS3（其可靶向LIMK激酶）作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行高通量篩選。總共產(chǎn)生了大約38000張圖像的數(shù)據(jù)集。代表性圖像如圖2B所示，表明BMS3和UM164的小分子能夠抑制OVCA432-nAc-citrine細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白聚合。

接下來(lái)，研究者開(kāi)發(fā)了一個(gè)深度學(xué)習(xí)渠道，使用人工智能框架分析帶有核F-肌動(dòng)蛋白的OVCA432 - nAc -citrine細(xì)胞(圖2C)。此研究使用的深度學(xué)習(xí)模型基于YOLOv5, YOLOv5是YOLO系列的最新版本。在該模型中，利用框架的焦點(diǎn)層來(lái)降低模型的權(quán)重。在使用標(biāo)注的細(xì)胞進(jìn)行訓(xùn)練和驗(yàn)證的環(huán)節(jié)中(圖2C)，對(duì)總細(xì)胞檢測(cè)的準(zhǔn)確率為0.958，召回率為0.891，對(duì)核F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞檢測(cè)的準(zhǔn)確率為0.917，召回率為0.904。重要的是，將未標(biāo)注的細(xì)胞隨機(jī)分配給人工計(jì)數(shù)總細(xì)胞或核F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞，結(jié)果與深度學(xué)習(xí)模型一致。因此，該模型是一個(gè)可行的工具，以支持進(jìn)一步的圖像分析在高通量水平。該模型的應(yīng)用使研究者能夠識(shí)別調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白組織的小分子抑制劑(圖3A)。研究者匯集了小分子抑制劑，使細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白含量降低20%以上的細(xì)胞，或使細(xì)胞核F-肌動(dòng)蛋白含量提高15%以上的細(xì)胞。這些抑制劑的激酶靶點(diǎn)見(jiàn)補(bǔ)充圖S3A,B。然后，他們使用這些激酶靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。這表明PI3K-AKT可能參與卵巢癌細(xì)胞中核F-肌動(dòng)蛋白組織(圖3B)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，研究者選擇了所有具有深度學(xué)習(xí)算法特征的激酶，因?yàn)樗鼈兛梢灾厮芎薋-肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)。36種抑制劑被證明與PI3K-AKT通路相關(guān)，其中23種抑制劑具有抑制核F-肌動(dòng)蛋白聚合的作用，而其他13種抑制劑則具有促進(jìn)核F-肌動(dòng)蛋白聚合的作用。隨后，他們使用這36種抑制劑處理OVCA432-nAc-citrine細(xì)胞，同時(shí)DMSO作為陰性對(duì)照，BMS3作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示：下調(diào)組的21種抑制劑和上調(diào)組的4種抑制劑對(duì)核F-肌動(dòng)蛋白組織的調(diào)節(jié)作用一致(圖3C,D)。因此，研究者確信PI3K-AKT通路在核F-肌動(dòng)蛋白形成中發(fā)揮重要作用。

圖2 利用小分子抑制劑庫(kù)進(jìn)行高通量篩選 圖3 卵巢癌細(xì)胞中參與核F-肌動(dòng)蛋白組裝的激酶的鑒定

 

主要結(jié)論

此研究揭示了F-肌動(dòng)蛋白存在于卵巢癌細(xì)胞系的細(xì)胞核中，更重要的是，此研究在新鮮冷凍腫瘤切片中揭示了核F-肌動(dòng)蛋白的組織。卵巢癌的一線治療是細(xì)胞修復(fù)手術(shù)結(jié)合化療藥物，包括鉑類(lèi)藥物。由于鉑類(lèi)藥物通過(guò)連接DNA堿基誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷，因此檢測(cè)核F-actin是否參與卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)，以及這些結(jié)構(gòu)在卵巢癌的背景下是否具有臨床意義將是十分重要的。

 

參考文獻(xiàn)

Wu W, Xing X, Wang M, Feng Y, Wietek N, Chong K, El-Sahhar S, Ahmed AA, Zang R, Zheng Y. Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning. Front Cell Dev Biol. 2022 May 26;10:869531. doi: 10.3389/fcell.2022.869531. PMID: 35693931; PMCID: PMC9178185.