文獻解讀：MMP21雜合子變異與中國漢族兒童可遺傳內臟異位綜合征相關
期刊：Human Genomics：6.48分
測序技術：WES（外顯子測序）-伯豪合作文章
在81名患童中選取的25名作為篩選隊列(30.9%)進行外顯子測序(表1)。本文總共識別了28種錯誤的致病性(或可能的)變異，其中11個已知的基因突變和HTX 相關，包括：DNAH5, DNAI1, GALNT11, MEGF8, MMP21, NODAL, NPHP4, PKD1L1, ROCK2, SHROOM3, SMAD2 。
此外，三個罕見MMP21雜合子錯義突變在三個不相關的中國漢族患者中被發現，具體的突變情況以及心臟畸形的部位：p.G244E-右位心臟；p.L277F-右位心臟且右心房異構；p.K487E-右心房異構(表2)。
通過Sanger測序，把患童MMP21基因的突變位點和他們的雙親進行對比(圖，1A)。而這三個MMP21的基因突變位點主要分布在3號外顯子和7號外顯子(圖，1B)。在對應的氨基酸序列來看，突變的區域在鋅依賴性MMP催化域(ZnMC_MMP) 和血紅素樣重復序列(HX超家族) (圖，1C)。這些氨基酸取代位點在多種脊椎動物中高度保守，如(圖1D)所示，MMP21蛋白的氨基酸序列比對中使用Clustal X軟件，這也說明突變導致的氨基酸取代可能導致MMP21蛋白功能的改變。為了進一步研究變異的功能效應，我們使用SWISS-MODEL構建了WT和突變MMP21蛋白的三維結構(圖1E)。
2. MMP21的突變不影響其本身的表達
為了進一步探索MMP21突變對其本身表達的影響，本文構建了MMP21突變的HEK293T細胞株，除了空白質粒載體，還分別構建質粒：pCMV3-MMP21-mut1 (p.G244E)；pCMV3- MMP21-mut2 (p.L277F)；pCMV3-MMP21-mut3 (p.K487E)。采取單獨突變轉染和共轉染(WT/mutant=1:1)兩種方式，并進行RT-qPCR檢測，結果顯示單獨或是共轉染的方式都不影響MMP21轉錄水平的改變。通過Western blot進行檢測，結果顯示MMP21突變在蛋白水平也沒有顯著影響，雖然在單獨轉染Mut3蛋白有一定的下調但是統計沒有顯著性差異(p=0.0529)。(圖2)
3. 突變的MMP21 mRNA c.731G>A (mut1) 和c.1459A>G (mut3) 未能逆轉SB - MO敲低MMP21引起的斑馬魚心環紊亂
為了研究確定的突變是否影響MMP21蛋白功能及其在左右軸向發育中的作用，通過SB-MO微注射構建了MMP21敲降斑馬魚模型。通過顯微注射構建模型，前期還通過不同的濃度做了預實驗，RT-qPCR結果表明對照MO和SB-MO(splice-blocking Morpholino oligo)的1.0 mM注射濃度下，有效阻斷斑馬魚中MMP21的剪接。(圖3A)。
利用clmc2的反義鏈RNA設計探針所謂斑馬魚心內心管的標記物，通過原位雜交判斷心臟的位置。基于受精孵育48h (48hfp)的胚胎進行對比，發現WT組或者處理對照組心臟循環的方向在右方(D-loop)，但是SB-MO組的心臟循環更多是不正常的狀態，比如L-loop或者沒有循環，甚至會出現尾部畸形或者脊柱彎曲。(圖3B)。
4. WT&Mut1(c.731G>A)和WT&Mut3(c.1459A>G)雜合子MMP21 mRNA不能完全逆轉 mmp21引起的心環異常
在MMP21敲降斑馬魚中，再分別顯微注射，wtMMP、Mut1MMP(c.731G>A: p.G244E)、Mut2MMP(c.829C>T: p.L277F)、Mut3MMP(c.1459A>G: p.K487E)對應的mRNA,觀察胚胎心臟畸形是否改善。結果顯示當注射正常wtMMP時候，可以有效減少斑馬魚胚胎畸形的概率(13.63% vs. 2.51%, p<0.0001)。不同的突變體進行對比發現，Mut1MMP和Mut3MMP的逆轉胚胎畸形的效果不如正常wtMMP的結果,另一方面Mut2的逆轉效果比較好，并且和wtMMP的結果比較接近。(圖4A，B)同時設計混合共注射分組（WT：mutant mRNAs = 1:1），模擬雜合子的情況，結果顯示混合后畸形率有了很大的改善，但是仍然高于wtMMP組。(WT&Mut1: 25.06% vs. WT: 13.76%, p<0.0001；WT&Mut3: 22.32% vs. WT: 13.76%, p=0.0008)。這些結果表明，p.G244E和p.K487E可能具有顯性負效應，并增加異常左右模式的易感性。支持它們的功能和臨床相關性。
參考文獻：
Qin XJ, Xu MM, Ye JJ, et al. De novo disruptive heterozygous MMP21 variants are potential predisposing genetic risk factors in Chinese Han heterotaxy children. Hum Genomics. 2022;16(1):41. Published 2022 Sep 19. doi:10.1186/s40246-022-00409-9
