染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟
染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的經(jīng)典方法。
開始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實(shí)驗(yàn)查找適合的抗體
（2）優(yōu)化染色質(zhì)剪切
（3）評(píng)估您的 ChIP 實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒?br />
五個(gè)步驟獲得理想 ChIP 結(jié)果
Step1：交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分
第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。
接下來，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。
注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。
Step2：染色質(zhì)片段化——DNA片段化
細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間。剪切是最難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
Step3：免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。抗體免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。
使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
Step4：制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化
現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。
Step5：定量DNA——測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平
在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
開始 ChIP 之前要考慮三件事
（1）為您的實(shí)驗(yàn)查找適合的抗體
（2）優(yōu)化染色質(zhì)剪切
（3）評(píng)估您的 ChIP 實(shí)驗(yàn)?zāi)芊癯晒?br />
五個(gè)步驟獲得理想 ChIP 結(jié)果
Step1：交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分
第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析。交聯(lián)劑在整個(gè)過程中保持復(fù)合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。
接下來，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。
注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定。 經(jīng)過交聯(lián)，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。
Step2：染色質(zhì)片段化——DNA片段化
細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間。剪切是最難控制的步驟之一。通過超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作，適用于大量樣品的處理，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存。避免反復(fù)凍融。
Step3：免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物
使用抗體捕獲蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中的目標(biāo)蛋白質(zhì)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素。抗體免疫沉淀并從細(xì)胞核組分中分離蛋白質(zhì)，去除不相關(guān)的細(xì)胞物質(zhì)。
使用抗體結(jié)合磁珠完成所得抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物的純化。經(jīng)過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，純化并洗脫蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。
Step4：制備DNA——解交聯(lián)和DNA純化
現(xiàn)在含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的染色質(zhì)片段已分離，需要解交聯(lián)并純化DNA。解交聯(lián)通常采用高熱孵育和/或消化來完成。
注意：此時(shí)可以停止ChIP。經(jīng)過解交聯(lián)和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲(chǔ)存。
Step5：定量DNA——測(cè)定目標(biāo)蛋白質(zhì)-DNA水平
在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產(chǎn)物，通過qPCR，您可以確定目標(biāo)蛋白是否存在于特定位點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)：
- thermofisher
- doi.org/10.1038/s41467-020-18900-z
- Target-BS技術(shù)揭示糖尿病引發(fā)勃起功能障礙的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制
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