2.轉(zhuǎn)移性腫瘤富集免疫抑制細胞，尤其是MRC1+CCL18+M2-like巨噬細胞
考慮到患者的細胞組成不同，文章使用scDC來估計細胞比例，過濾了低豐度的免疫細胞，聚類免疫細胞比例(下圖A)。在未處理的樣本中，免疫細胞豐度可分為六種不同的模式(鄰近結(jié)直腸癌高、結(jié)直腸癌高、鄰近肝臟高、LM高、結(jié)直腸癌高和肝臟高)。鄰近的結(jié)直腸癌樣本顯示AIM2+記憶B細胞、TCLIA+-naive B細胞和CD4+-naive T細胞比例最高，而結(jié)直腸癌樣本大多富集FOXP3+ Tregs。MAIT細胞、NK細胞和FGFBP2+GZMB+ CD8+ T細胞在鄰近的正常肝組織中富集。相反，肝轉(zhuǎn)移中特異性存在一些免疫抑制細胞，其中SPPI+巨噬細胞和MRCI+ CCL18+巨噬細胞急劇增加(圖2B)。文章發(fā)現(xiàn)MRCI+CCL18+巨噬細胞具有Kupffer細胞特征，這表明它們可能來源于肝Kupffer細胞。中性粒細胞，據(jù)報道作為潛在的原體參與者，也在肝轉(zhuǎn)移中富集(下圖B)。我們進一步使用單樣本基因集富集分析(ssGSEA)來量化免疫細胞亞群的空間分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MRCI+ CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞在未經(jīng)治療的肝轉(zhuǎn)移中富集(下圖C)。這些數(shù)據(jù)與scRNA-seq的數(shù)據(jù)部分一致，進一步證實了肝轉(zhuǎn)移的潛在抑制性TME。

文章使用多重免疫組化(mIHC)對另外27例CRLM患者(n = 18，未經(jīng)治療;n = 9, NAC-PR)。在未經(jīng)處理的樣本中，觀察到FOXP3+ Tregs、MRC1+ CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移中的浸潤顯著增加，這與scRNA-seq數(shù)據(jù)基本一致(圖F)。其次，文章利用ssGSEA對CRLM的批量微陣列數(shù)據(jù)集中的免疫細胞進行評分。文章檢查了原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的細胞豐度。在該驗證隊列中，MRCI+ CCL18+巨噬細胞、SPP1+巨噬細胞和中性粒細胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤中均顯著升高。TCGA數(shù)據(jù)隊列中原發(fā)腫瘤中MRC1+CCL18+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞的高評分均預(yù)示預(yù)后明顯較差。推測特定的巨噬細胞亞群可能在CRLM中原生細胞生態(tài)位的形成中起著重要作用。

3. 轉(zhuǎn)移性腫瘤中巨噬細胞轉(zhuǎn)向抑制狀態(tài)
鑒于肝臟轉(zhuǎn)移中巨噬細胞亞群的富集，文章假設(shè)這些肝臟轉(zhuǎn)移富集的巨噬細胞在不同的組織中可能具有不同的功能。因此，我們進行基于配體受體的癌癥免疫串?dāng)_分析，比較原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位。結(jié)果顯示SPP1+巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞在肝轉(zhuǎn)移和結(jié)直腸癌的所有不同的交叉通話細胞類型中排名較高。這一結(jié)果表明，肝轉(zhuǎn)移性癌細胞可能會優(yōu)先重編程巨噬細胞并誘導(dǎo)其特定的功能狀態(tài)(下圖A)。值得注意的是，肝轉(zhuǎn)移中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞優(yōu)先表達配體CD47。文章進一步利用mIHC對這些蛋白進行共表達可視化。這些配體受體對特異性富集于肝轉(zhuǎn)移，為靶向治療肝轉(zhuǎn)移提供了線索。

為了精確定位特異的TME印跡的差異，文章在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移巨噬細胞之間進行了差異基因表達分析。APOE和其他M2極化相關(guān)基因如MARCO也在肝轉(zhuǎn)移富集的MRC1+CCL18+巨噬細胞中顯著上調(diào)(下圖E)。相比之下，富集于結(jié)直腸癌的MRC1+CCL18+巨噬細胞具有更高水平的炎性細胞因子表達，包括TNF、ILIB、CCL3和CCL4。通路富集分析顯示(下圖F)，在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移的MRC1+ CCL18巨噬細胞中，代謝通路都顯著富集，突出了代謝在決定這些巨噬細胞功能中的基本作用。值得注意的是，文章發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中MRC1+ CCL18t巨噬細胞富集氧化磷酸化，而肝轉(zhuǎn)移中MRC1+ CCL18t巨噬細胞以氨基酸代謝為主。這些數(shù)據(jù)強調(diào)，代謝調(diào)節(jié)可能介導(dǎo)巨噬細胞的表型和功能轉(zhuǎn)移，以響應(yīng)不同的微環(huán)境改變。
 

4. 在肝轉(zhuǎn)移中MRC1+CCL18+巨噬細胞代謝活性急劇增加
為了了解髓系細胞在CRLM中的代謝圖景，文章通過scMetabolism計算抑制性巨噬細胞和單核細胞在每一條代謝通路中的活性得分。結(jié)果顯示肝轉(zhuǎn)移浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞在所有髓系細胞中表現(xiàn)出最高的代謝活性，表明它們非常有活力，這可能與它們在轉(zhuǎn)移部位的獨特功能有關(guān)。進一步對MRC1+ CCL18+巨噬細胞的所有代謝相關(guān)基因進行無監(jiān)督聚類，觀察到與周圍組織相關(guān)的強烈代謝偏好，在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中鑒定出42種可能上調(diào)的代謝途徑。差異表達的代謝基因并發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性浸潤的MRC1+ CCL18+巨噬細胞中代謝基因特異性上調(diào)。ILAI1和MIF是巨噬細胞激活所必需的基因也表現(xiàn)出類似的特征。文章使用mIHC驗證了這些代謝酶，觀察到基本一致的結(jié)果。結(jié)果表明代謝在決定MRC1+ CCL18+巨噬細胞表型中起著重要作用。

5. NAC響應(yīng)與非響應(yīng)性腫瘤包含獨特的免疫動態(tài)
為了探索NAC對抗腫瘤免疫的影響，文章使用TooManyCells對所有CD45+細胞進行了聚類分析。結(jié)果表明結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移的細胞聚類有明顯的差異（下圖A）。NAC對TME的影響具有高度的細胞類型特異性和環(huán)境依賴性（下圖B\C）。通常，在PR腫瘤中，NAC可以下調(diào)免疫抑制細胞并激活細胞毒性細胞。在肝轉(zhuǎn)移中，反應(yīng)性NAC下調(diào)了SPP1+巨噬細胞，上調(diào)了GZMK+ CD8+ T細胞和XCL1+ CD8+ T細胞等細胞毒性T細胞，特別是在NAC- pr腫瘤中保留了幾個MRC1t+CCL18+巨噬細胞和幾十個SPP1+巨噬細胞，提示NAC在抑制巨噬細胞譜系中的潛在作用。然而，在PD/SD腫瘤中，存在與PR腫瘤不同的免疫細胞變化。例如，肝轉(zhuǎn)移中SPP1t巨噬細胞和MRC1+ CCL18+巨噬細胞水平升高，而細胞毒性免疫細胞(即FGFBP2+GZMB+CD8+ T細胞)水平下調(diào)(下圖C、E和F)。這些相反的結(jié)果可能是由器官特異性和治療療效相關(guān)的癌細胞重塑所解釋的。總之，這些結(jié)果表明，有效的NAC不僅能重編程腫瘤內(nèi)免疫平衡，還能激活全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，為支持NAC在可切除的CRLM中的潛在應(yīng)用提供了證據(jù)。
 

結(jié)論
本文使用scRNA-seq和ST.定義了CRLM的細胞和空間免疫景觀。數(shù)據(jù)顯示，在肝轉(zhuǎn)移中，免疫微環(huán)境經(jīng)歷了廣泛的時空重塑，免疫抑制細胞顯著富集，這與之前基于大量樣本的研究一致。特別是，MRC1+ CCL18+巨噬細胞表現(xiàn)為終末分化狀態(tài)，表現(xiàn)為代謝活躍的表型，對新輔助化療敏感。該研究不僅揭示了以前未被認(rèn)識到的CRLM免疫生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，而且為癌癥研究界提供了更為全面的資源。

參考文獻：
Wu Y, Yang S, Ma J, Chen Z, Song G, Rao D, Cheng Y, Huang S, Liu Y, Jiang S, Liu J, Huang X, Wang X, Qiu S, Xu J, Xi R, Bai F, Zhou J, Fan J, Zhang X, Gao Q. Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level. Cancer Discov. 2022 Jan;12(1):134-153. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0316. Epub 2021 Aug 20. PMID: 34417225.