I型干擾素（IFN-1）病是近年來概念較新的一組疾病，屬于免疫缺陷病中的自身炎癥性疾病，以體內I型干擾素過度激活表達造成炎癥損傷為突出特點，表現為不明原因的全身性炎癥，不易診斷，發病率低，并且沒有好的治療方法[1]。Aicardi-Goutières（艾卡迪-古特雷斯，簡稱AGS）綜合征便是其中之一。AGS由1984年首次提出，是一種主要影響大腦、免疫系統和皮膚的罕見遺傳疾病，且無法治愈。目前已發現7種致病基因：TREX1、RNASEH2A、RNASEH2B、RNASEH2C、SAMHD1、ADAR以及IFIH1。

基因缺陷疾病最根本的治愈方法是基因編輯療法，糾正突變的基因，但由于其存在脫靶效應、安全性質疑、倫理問題等，對全身性基因缺陷疾病進行基因編輯仍不現實，亟需針對AGS的發病機理以及分子機制的進一步研究，以設計生產出對應的治療藥物。

Nature
2022年7月20日，Nature期刊同時刊登四篇文章均用到Incucyte® 實時活細胞成像分析系統！其中三篇同時報道了對AGS綜合征罕見病的重大研究進展，發現了一種ADAR1突變型AGS綜合征的全新發病機制，為治療提供了新的靶點和思路。這三篇文章具體報道了什么，又是如何應用Incucyte® 的呢？

 
 
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下面我們以德國科隆CECAD 研究中心的Manolis Pasparakis教授團隊（第一作者為焦會朋博士和Laurens Wachsmuth博士）發表的其中一篇題為“ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1”為例詳細講一講研究的思路以及Incucyte® 在基礎研究中的應用[2]。
 
 
研究背景
ADAR1突變是病因之一。ADAR1蛋白有兩種亞型，核內表達的結構性p110及胞質內表達的含有Zα區域的p150，p150含有1個Zα結構域、1個脫氨酶結構域和3個dsRNA結合結構域。脫氨酶結構域催化dsRNA的A-to-I編輯，Zα結構域特異性識別和結合左旋核酸（Z-nucleic acids，Z-NAs）[3]。大部分的患者編碼該區域的序列發生點突變導致人ADAR1中193位的脯氨酸變為丙氨酸[4]，且模擬AGS患者小鼠模型表現出MDA5-MAVS依賴的致病性IFN-1應答[5]。這就表明ADAR1 Zα結構域同Z-NAs的相互作用能夠抑制致病性IFN-1應答。
   
研究結果
為了模擬人類ADAR1突變誘發的AGS患者，作者首先構建ADAR1 Zα結構域（N175D/Y179A）突變的雜合子小鼠（Adar1mZα/-），該小鼠表現產后致死，伴隨紅細胞生成缺陷、腸道細胞大量死亡和不同組織中IFN-1應答的上調，且MAVS-/-完全逆轉AGS的病理學表型，說明依賴于MAVS信號通路，這與之前的研究成果一致。

ZBP1是哺乳動物中除ADAR1外唯一含有Zα結構域的蛋白，是一個干擾素誘導表達的蛋白，在調控細胞死亡、抗病毒反應、炎癥反應和組織穩態過程中發揮重要作用[6]。作者進一步發現ZBP1缺失能夠不完全抑制上述病理表型：產后致死、紅細胞生成缺陷以及腸道和腎臟病變等。而表現出AGS疾病表型的另一種Adar1雜合及Mavs雜合小鼠，也能被ZBP1敲除不同程度地逆轉。綜上所述，ZBP1是促進Adar1mZα/-小鼠致病性IFN-1應答的關鍵蛋白。

在這部分結果中，使用的都是半敲小鼠，在純合敲除小鼠中，發現大約40%的 Adar1-/- Zbp1-/-Mavs-/-小鼠存活到成年期。探究ZBP1-RIPK3的作用在Adar-/-小鼠中的作用時，作者分離小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），與Mavs-/- MEFs相比，少量蛋白質翻譯抑制劑CHX處理IFNγ 預刺激的細胞（刺激ZBP1表達）導致Adar1-/-Mavs-/-中的細胞死亡增加，ZBP1敲除阻止了死亡表型（表1）。說明ZBP1-RIPK3依賴性信號促進Adar1-/-Mavs-/-小鼠的MAVS非依賴性病理。
 
表1Incucyte® 統計的實時細胞死亡的信號強度
 
那ZBP1是如何促進Adar1 mZα/-小鼠IFN-1應答的呢？Zα結構域可以識別左旋DNA和RNA，是否是通過特異性結合某種核酸實現的呢？

TREX1突變誘發的AGS小鼠模型（Trex1-/-），是通過自身DNA積累激活cGAS-STING，誘發I型干擾素上調和心肌炎的[7,8]，且ZBP1確實對于TREX1突變導致的表現沒有任何影響，這表明ZBP1可能特異性識別ADAR1突變誘發的左旋RNA的積累來促進病理表型的。RNA高通量測序（RNA-seq）發現小鼠內源性逆轉錄元件表達的上調和A-to-I編輯的下調，dsRNA在體內的積累，為ZBP1的激活提供了特異性的配體。ZBP1 Zα結構域的突變能夠抑制Adar1mZα/-小鼠的病理表型，證實ZBP1通過結合小鼠中積累的內源性Z-RNA促進疾病表型。
 
ZBP1結合Z-RNA以后又是如何激活下游信號通路，調控IFN-1應答，進而促進疾病表型的呢？
 
之前的研究表明ZBP1可以誘發的RIPK3依賴的FADD-Caspase-8介導的細胞凋亡（apoptosis）、MLKL介導的程序性細胞壞死（necroptosis）以及RIPK1介導的促炎反應[9]，作者對已有的研究結果進行驗證，發現Ripk3-/-、Mlkl-/-、Fadd-/- Mlkl-/-、Fadd-/- Ripk3-/-和Ripk1mR/mRMlkl-/-等突變都無法逆轉Adar mZα/-小鼠的病理表型，這表明ZBP1促進致病性I型干擾素應答與已有的信號通路無關，具體機制有待于進一步研究。
 
結論
在這篇文章中，研究人員發現ZBP1是促進ADAR1 Zα結構域突變的半合子小鼠（Adar1 mZα/-）引起的致病性I型干擾素應答的關鍵分子，為治療提供了新的靶點，并且提出存在一種不依賴于細胞死亡的全新致病機制的可能。
 
 
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同樣，來自華盛頓大學的Andrew Oberst團隊發表題為“ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology”的文章[10]，他們也發現ADAR1致病是由ZBP1激活驅動的，但ZBP1激活導致細胞死亡是由于PIPK3和MLKL的磷酸化，且依賴于caspase 8，這與焦博士的結論有所不同。

在研究下游通路的過程中，作者使用Incucyte® 對密集時間點的實時細胞死亡情況進行檢測，提供了可靠的數據支持。下面為文中利用Incucyte® 做出的結果：
 
為了探索ADAR1改變激活的ZBP1下游通路，用半胱天冬酶抑制劑zVAD處理它們會導致ZBP1依賴性RIPK3磷酸化和細胞死亡，加入PIPK3磷酸化抑制劑GSK843逆轉細胞死亡表型（圖2），證明Adar P195A/p150null細胞對ZBP1依賴性壞死性凋亡敏感。
 

圖2Caspase抑制劑zVAD處理8小時后（激活PIPK3依賴性細胞死亡），使用Incucyte® 測量細胞死亡。
 
同時ADAR1的缺失也激活ZBP1介導的caspase-8依賴的凋亡和MLKL依賴的壞死性凋亡。為了證明ZBP1與RIPK1相互作用激活caspase-8依賴性細胞凋亡，作者設計了一種直接巧妙的激活ZBP1的還原系統，用衍生自蛋白質FK506的串聯誘導型二聚化結構域替換ZBP1的ZBD，使用可滲透細胞的小分子B/B激活。實驗表明，盡管RIPK3促進 ZBP1 依賴性細胞凋亡，但在沒有RIPK3的情況下，ZBP1仍然可以驅動caspase-8依賴性細胞死亡反應（圖3）。
 

圖3 Incucyte® 檢測死亡細胞比例
 
 
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這還沒結束，比利時的Jonathan Maelfait團隊也發表一篇Nature文章“ ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation”[11]，該文章的亮點是：ADAR1改變導致dsRNA形成，與ZBP1結合自激活，而ZBP1激活會導致caspase-8依賴性細胞凋亡和MLKL介導的ADAR1缺陷細胞的壞死性凋亡，進而導致胚胎致死表型。

為了確定哪些信號通路導致ADAR1缺陷細胞死亡，用IFNα處理原代小鼠肺成纖維細胞以誘導ZBP1表達，為了排除自發MDA5和MAVS或TNF信號傳導對細胞存活的混雜影響，加入TNF中和抗體。用IFNα和蛋白質合成抑制劑放線菌酮 (CHX) 刺激 ADAR1 缺陷型成纖維細胞，增強TNF誘導的細胞死亡，誘導ZBP1介導的細胞死亡（圖4）。結果證明ZBP1激活導致RIPK3的募集，從而誘導RIPK1-FADD-caspase-8介導的細胞凋亡和MLKL介導的壞死性凋亡的平行途徑。
 

圖4 Incucyte® 實時檢測原代小鼠肺成纖維細胞死亡
 
為了測試dsRNA結構是否能刺激ZBP1，研究者將來自NICN1和BPNT1 mRNA的3'UTR的轉錄Alu-Alu雜合體體外轉染到表達人ZBP1的HT-29細胞中。兩種Alu-Alu雜交體都強烈誘導ZBP1依賴性細胞死亡，這依賴于完整的ZBP1 Zα結構域，并且可以被zVAD-FMK抑制，并且與GSK’84聯合對細胞死亡的抑制效果更強（圖5）。
 

圖5 dsRNA誘導ZBP1突變細胞死亡，Incucyte® 檢測死亡陽性細胞比例
 
這三篇Nature文章同時揭示了ADAR1改變導致AGS綜合征是由于ZBP1的激活引發的全新機制，盡管研究后續信號通路時結論有所不同，但都進一步支持ZBP1是哺乳動物dsRNA的感受器的觀點。
 
 
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除了以上三篇，同一天還有第四篇Nature文章“Mechanisms of APOBEC3 mutagenesis in human cancer cells”，來自美國的MIT和哈佛大學博德研究院John Maciejowski團隊。研究人員建立了單堿基置換（single-base substitutions，簡稱SBS）特征標簽與人類腫瘤細胞基因組上內源性APOBEC3之間的聯系[12]，在這篇文章中，腫瘤細胞的增殖能力強，可以進行長時間的觀察，研究者利用Incucyte® 連續監測了20天（480h!!!）細胞的增殖情況（圖6）。
 

圖6 Incucyte® 以匯合度(Confluence)實時檢測REV1敲除后細胞的增殖

Summary

總而言之，在上述研究中體現出Incucyte®長時程活細胞成像與分析系統獨特優勢：

自動檢測，提升實驗效率：滿足密集時間點以及長時間監測的需求，一次實驗得到大量數據，解放人力，是從事細胞研究不可或缺的工具；

分析簡便，提升數據質量：軟件采集及分析模塊配合熒光檢測試劑，得到高度可靠的數據。實時檢測整個細胞死亡/凋亡曲線，在細胞死亡狀況較為接近的情況下，仍然在大量數據的前提下得到確切的結論；

6板位設計，多實驗同步開展：內設6個板位，可以分別獨立設置檢測程序，滿足6組不同實驗或多人實驗同時檢測的需求。
 
Download - 參考文獻 - 
[1]Cetin Gedik K, Lamot L, Romano M, et al. The 2021 European Alliance of Associations for Rheumatology/American College of Rheumatology points to consider for diagnosis and management of autoinflammatory type I interferonopathies: CANDLE/PRAAS, SAVI and AGS[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2022, 81(5): 601–613.
[2]Jiao H, Wachsmuth L, Wolf S, et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1[J]. Nature, Nature Publishing Group, 2022, 607(7920): 776–783.
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