發表期刊：Cell Metabolism

影響因子：22.415

發表時間：2018年

合作單位：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院

今天BIOTREE百趣代謝組學將給大家分享阿趣生物協助客戶發表在Cell Metabolism上的一篇文章：Short-Term Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening Modulates Histone Lysine Methylation at the Early Phase of Somatic Cell Reprogramming。

什么是“線粒體閃爍”?橫跨線粒體內外膜的線粒體通透性轉換孔（mPTP）的瞬時開放稱為“線粒體閃爍”[1]。mPTP在細胞的生存和凋亡中起到了決定性的意義。孔完全開放會導致細胞的凋亡，孔的瞬時開放會調控細胞的發育。

百趣代謝組學文獻分享，線粒體在多能干細胞（一種具有自我更新，自我復制能力的多潛能細胞）的發育中起到重要作用，而體細胞再編程到誘導多功能干細胞重構染色質的修飾，這一過程是否以及如何通過線粒體中的信號進行調節還不得而知。

那么什么又是體細胞重編程呢？對一個分化成熟的細胞來說，其細胞核全能性的實現是建立在與卵細胞質融合基礎上的。這種由體細胞向全能細胞的轉變稱為體細胞重編程[2]。大家熟知的克隆羊多莉就是這么“問世”的。

但現在要實現這一目的，體細胞核移植并不是唯一手段。2006年日本科學家山中伸彌(Shinya Yamanaka)首次利用病毒載體將四個轉錄因子的組合轉入分化的體細胞中，使其重編程而得到了類似胚胎干細胞的一種細胞類型——誘導多能干細胞(iPSCs)。百趣代謝組學文獻分享，該成果在2012年被授予了諾貝爾生理學/醫學獎。

mPTP的開放及關閉對細胞的凋亡及發育產生的影響這背后是否以及是如何調控細胞核的還是未知的。百趣代謝組學文獻分享，基于以上結果，學者將研究的重心轉移至mPTP。研究發現在重編程的早期mPTP經歷了短期開放，這種短暫的激活增強了重編程。短期mPTP的打開觸發線粒體ROS/miR-101c通路，增強PHF8（結構同源植物域指蛋白）介導的多能性基因的H3K9me2/H3K27me3去甲基化，降低其在多能基因啟動子區的占有率，提高重編程效率。

在重新編程的早期階段
mPTP的短期開放

為了確定mPTP在重編程過程中的狀態，對小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)在Sox2、Klf4、Oct4、c-Myc (SKOM)介導的重編程過程中的mPTP進行了監測。百趣代謝組學文獻分享，研究發現mPTP的開放度在第3天增加，在第5天再次下降，并在第8天保持這個水平，鈣黃綠素熒光染劑（Calcein）與mPTP開放程度呈負相關（圖A, B）。
 

注：A: 共聚焦圖像在重新編程的第0、3、5和8天分析mPTP的開放情況。樣品與calcein和CoCl2共載。B:  細胞相對殘留鈣黃綠素熒光在重編程過程中分別于第0、3、5、8天的定量情況。
 

早期的mPTP開放增強了重新編程

為了確定mPTP在重編程中起到的作用，研究人員區分了包含轉基因 Oct4 促進因素驅動綠色熒光蛋白（GFP）表達在內的MEFs (小鼠胚胎成纖維細胞)，根據鈣黃綠素熒光的強度確定mPTP的放開。百趣代謝組學文獻分享，圖中可以看出高mPTP開放細胞的重編程效率高于低mPTP開放的效率（圖C）。
 

注：對高、低mPTP開放度的skom感染細胞進行排序后，定量分析重組效率。

為了進一步研究mPTP在重編程中的作用，研究人員通過增加或減少功能的方法來調節mPTP的打開。百趣代謝組學文獻分享，他們發現關鍵的mPTP組分親環素D（CypD）的過度表達導致mPTP打開，而CypD沉默抑制mPTP打開，這是一種線粒體基質肽基脯氨酰順反式異構酶，目前已知的可調節mPTP的開放(圖D)。
 

注：D: 在CypD過表達或沉默的條件下，用shRNA分析mPTP的開放情況。左圖為典型的共焦圖像，右圖為殘留鈣黃綠素熒光的定量。

CypD過表達H3K9me2和H3K27me3
的去甲基化依賴于PHF8

檢測了有或沒有CypD過表達的細胞重編程第3天組蛋白的甲基化狀態。百趣代謝組學文獻分享，實驗發現，與對照組相比，在CypD過表達重編程的第3天和第4天，H3K9me2和H3K27me3的水平下降(圖E)，而其他測試組沒有顯示明顯的變化。通過H3K9me2和H3K27me3染色質免疫沉淀(ChIP)實驗分析其占用率，發現CypD過表達降低了其在Sox2、Nanog、Oct4等多能基因啟動子區域的占用率。

因此，mPTP的激活導致H3K9me2和H3K27me3的整體去甲基化。H3K9和H3K27的甲基化受多種組蛋白去甲基化酶的調控，為了找出哪些組蛋白去甲基化酶參與了mPTP的開放。我們檢測了不同組蛋白去甲基化酶在有或無CypD過表達的細胞SKOM重編程過程中的表達水平。結果表明，在被檢測的蛋白中，只有PHF8在CypD過表達時增加(圖F)。此外，研究人員在重編程中使用shRNA對PHF8進行沉默，發現敲除PHF8可以恢復H3K9me2和H3K27me3的水平，并通過CypD過表達削弱重編程效率的提高(圖G)。
 

注：E: 重組過程中CypD過表達第3天和第4天后H3K9me1/2/3和H3K27me1/2/3的Western blot分析。F: 重組后第3天和第4天CypD過表達細胞中PHF8的Western blot分析。G: H3K9me2和H3K27me3經PHF8 shRNA處理和不經PHF8 shRNA處理的CypD過表達細胞在重編程后第3天的Western blot分析。
 

靶標代謝組學對α-KG進行定量分析

PHF8催化賴氨酸去甲基化，需要a-酮戊二酸(a- KG)，這是三羧酸循環的中間代謝產物，采用超高效液相色譜串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)進行定量測定代謝物水平，研究人員通過代謝物分析來定量重編程中CypD過表達后的a-KG水平。百趣代謝組學文獻分享，CypD過表達細胞的a-KG水平高于對照組(圖H)。因此，a- KG的增加可能是PHF8活性增加的一個因素。
 

注：重組后第3天Flag和CypD過表達細胞中a-KG水平的高效液相色譜-質譜分析

結語

本實驗發現線粒體通透性轉換孔（mPTP）在重編程的早期經歷了短期開放，mPTP的開放使H3K9me2和H3K27me3發生去甲基化，導致它們在細胞中的多能性基因的啟動子區域占有率降低。mPTP的開放增加了線粒體活性氧產物下游的PHF8蛋白水平和mir-101c，同時也提高了PHF8的輔因子a-酮戊二酸的水平。從而促進體細胞轉變為多能干細胞。

百趣代謝組學文獻分享，研究結果表明，在mPTP介導的表觀遺傳調控下，線粒體到核的新途徑決定了細胞的命運。同時進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離。而該方法與經典的胚胎干細胞和體細胞核移植技術不同的是，它不使用胚胎細胞或卵細胞，所以沒有倫理學問題。雖然該方法的安全性還有待考量，但在發病機理以及疾病診斷等醫學方面都有巨大的潛力，值得未來深入地研究及學習。

參考文獻
[1]Ying Z , Chen K , Zheng L , et al. Transient Activation of Mitoflashes Modulates Nanog at the Early Phase of Somatic Cell Reprogramming[J]. Cell Metabolism, 2015, 23(1).

[2]安威．醫學細胞生物學（第三版）：北京大學醫學出版社，2013